| 公開(公告)號 | CN1563365A |
| 公開(公告)日 | 2005.01.12 |
| 申請(專利)號 | CN200410025939.X |
| 申請日期 | 2004.03.12 |
| 專利名稱 | 一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法 |
| 主分類號 | C12N5/08 |
| 分類號 | C12N5/08;C12N5/06;C12Q1/24 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 西北農(nóng)林科技大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 楊學(xué)義;竇忠英 |
| 地址 | 712100陜西省楊凌邰城路3號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 李鄭建 |
| 國省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項 | 一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)首先取一塊皮膚，置于含青鏈霉素的生理鹽水中，用含青鏈霉素的PBS(一)沖洗，去血污及毛發(fā)；2)在解剖鏡下將皮膚與皮下組織分開，將皮膚切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿中，每皿3-4塊，加培養(yǎng)基；培養(yǎng)基的配方為：Medium199+15～20％NBS即新生牛血清+5～8μg/mlinsulin(胰島素)+0.5μg/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml；3)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)的條件為5％CO2，飽和濕度，37℃，每兩天換液一次；4)經(jīng)3天-4天后，從組織塊邊緣長出上皮樣細(xì)胞鋪路石樣生長，7天-12天后，在上皮樣細(xì)胞層上有小圓形細(xì)胞聚集呈克隆樣生長，待這些克隆直徑達(dá)100-150μm時，在解剖鏡下挑取這些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA適當(dāng)處理，用玻璃針將這些細(xì)胞吸入鋪有明膠的3.5cm塑料皿中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；無血清培養(yǎng)基的配方為：F12+1～2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+20ng/mlIGF-1+0.4～0.6ug/ml氫化可的松+青鏈霉素100u/ml。5)待細(xì)胞增殖達(dá)75％融合時，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基將關(guān)中奶山羊表皮干細(xì)胞傳25代凍存，將人類表皮干細(xì)胞傳5代凍存；6)對所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測：CK19，integrin-β1P63，integrin-α6均為陽性，即證明所分選的是純化的表皮干細(xì)胞。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種分離純化皮膚表皮干細(xì)胞的方法，在皮膚組織塊培養(yǎng)過程中采用自行設(shè)計的培養(yǎng)基能有效抑制成纖維細(xì)胞的生長，從組織塊四周生長出均一的上皮樣細(xì)胞，誘發(fā)表皮干細(xì)胞遷移出原來的微環(huán)境，在新生成的上皮樣細(xì)胞層上重新聚集生長。這類克隆性生長的細(xì)胞與其依賴的滋養(yǎng)層細(xì)胞有明顯形態(tài)學(xué)上的差別。借助解剖鏡和玻璃針就能將其挑選出來，進(jìn)行單獨擴(kuò)增培養(yǎng)。對所獲得細(xì)胞進(jìn)行當(dāng)前同行公認(rèn)的表皮干細(xì)胞分子標(biāo)志的檢測：CK19，integrin-β1，p63，integrin-α6均為陽性，即證明所分選的是純化的表皮干細(xì)胞。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)酶消化法的缺點，直接利用干細(xì)胞的生物學(xué)行為獲得純化的表皮干細(xì)胞，可用于人類和哺乳動物表皮干細(xì)胞的分離純化。 |
| 國際公布 |
