| 公開(公告)號 | CN1844401A |
| 公開(公告)日 | 2006.10.11 |
| 申請(專利)號 | CN200610037837.9 |
| 申請日期 | 2006.01.17 |
| 專利名稱 | 一種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法 |
| 主分類號 | C12N15/63(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/63(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 孔 冬;高 翔;王鵬飛;章 念;鄭 斌 |
| 地址 | 210093江蘇省南京市漢口路22號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 南京蘇高專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 闕如生 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 一種快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法，其特征在于該方法的步驟為： A.5’和3’同源臂載體的構(gòu)建：利用特殊設(shè)計的PCR引物，以基因組DNA為模板，用LATaq酶擴增用于同源重組的5’和3’同源臂片段，目的PCR片段通過瓊脂糖凝膠分離并切膠回收后，分別與100-200ngpDONRP4-P1R或pDONRP2R-P3載體混合，在BPClonaseII酶切混合物的作用下進行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，序列的正確性用M13F、M13R引物正反測序驗證，裝配好的載體我們分別命名為pENTR5’和pENTR3’； B.中間載體的構(gòu)建：根據(jù)不同的實驗要求，對我們構(gòu)建的質(zhì)粒載體pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT進行改造，(1)常規(guī)基因敲除：不必做任何改造；(2)條件基因敲除或基因插入：將需要敲除或插入的片段用限制性內(nèi)切酶消化，然后用T4連接酶連接至pDONRloxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT載體中位于兩個loxP位點之間的多克隆位點即MCS，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)； C.最終載體的拼裝：將以上3種載體與pDEST-R4R3-TK載體各60-100ng混合，加入LRClonasePlus酶切混合物進行Gateway同源重組反應(yīng)，37℃保溫1小時后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌后于氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，對長出來的克隆進行擴增、純化即可得到最終的重組載體。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種借助于Gateway克隆系統(tǒng)的快速構(gòu)建基因打靶重組用載體的方法。首先，它用特殊設(shè)計的PCR引物進行PCR擴增，得到用于同源重組的5’和3’同源臂，通過BP重組反應(yīng)分別裝入pDONRP4-P1R和pDONRP2R-P3載體中；然后，將目的片段裝入我們創(chuàng)造性構(gòu)建的中間載體pDONR loxP/MCS/loxP-FRT/NEO/FRT中；最后，將以上3種載體與pDEST R4-R3TK載體的混合物在通過1小時快速LR重組反應(yīng)后，5’同源臂，中間片段，3’同源臂，以及TK負篩選元件便會自動按照設(shè)計的順序拼接，轉(zhuǎn)化并純化后即得到基因打靶用載體。該方法具有快速、靈活、省時、省力等優(yōu)點，并突破了傳統(tǒng)方法中內(nèi)切酶位點分布的限制，在基因功能研究方面有重要意義。 |
| 國際公布 |
