油酸型呼吸窘迫綜合征的發(fā)生與治療 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 復(fù)制油酸型呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome ，RDS)動(dòng)物模型，初步探討其發(fā)病機(jī)制。觀察藥物對(duì)油酸導(dǎo)致的急性肺損傷的防護(hù)作用。學(xué)習(xí)肺順應(yīng)性（pulmonary compliance)、肺系數(shù)、肺泡灌洗液表面張力等指標(biāo)測(cè)定方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 化學(xué)性因素油酸所致急性肺損傷主要是通過激活補(bǔ)體，產(chǎn)生趨化因子使中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、激活，釋放大量氧自由基、蛋白酶和花生四烯酸代謝產(chǎn)物等炎性介質(zhì)，對(duì)肺泡-毛細(xì)血管膜的損傷，使之發(fā)生通透性增高等變化而引起以肺水腫為主要病變的RDS。后者能導(dǎo)致通氣/血流比值失調(diào)及肺泡-毛細(xì)血管膜的彌散障礙，發(fā)生換氣功能障礙而引起呼吸衰竭。 肺順應(yīng)性是指肺在外力下的可擴(kuò)張性，與肺彈性阻力成反比。肺順應(yīng)性可用單位跨肺壓引起的肺容積變化來表示。RDS時(shí)，由于肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡表面活性物質(zhì)減少等因素導(dǎo)致肺順應(yīng)性下降，進(jìn)而影響肺通氣功能。 三莨菪堿（654-2)、二甲基亞砜（DMSO)、維生素C（VitC)、維生素E（VitE)等均為有效的抗氧化劑，可對(duì)抗炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的過氧化損傷。在靜脈注射油酸前，先給予上述藥物，觀察其對(duì)RDS時(shí)肺損傷的防護(hù)作用。 【實(shí)驗(yàn)器材和藥品】 充氣檢壓裝置、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、哺乳類動(dòng)物手術(shù)器材1套、兔手術(shù)臺(tái)、生理鹽水、氣管插管、注射器(100ml、10ml各1支)、20ml量杯、50ml燒杯2個(gè)、0.05ml刻度吸管2個(gè)。酒精燈、25%烏拉坦、油酸、654-2，50 %DMSO、醫(yī)用液體石蠟。血?dú)夥治鰞x。 【實(shí)驗(yàn)動(dòng)物】 家兔，體重約2.5kg。 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一、實(shí)驗(yàn)分組 取家兔3只稱重，分別固定于兔臺(tái)上，耳緣靜脈緩慢注射25%烏拉坦4ml/Kg麻醉。頸部手術(shù)作氣管插管、頸總動(dòng)脈插管。觀察一般狀況和記錄呼吸頻率及深度。從頸總動(dòng)脈采血，測(cè)定手術(shù)后血?dú)飧黜?xiàng)指標(biāo)（血pH、Pco2、Po2)。隨機(jī)將家兔分為3組： 1. 油酸RDS動(dòng)物模型組 耳緣靜脈注射油酸0.1ml/Kg，30分鐘后觀察并記錄呼吸的改變，再追加油酸0.1ml/Kg，每10分鐘觀察記錄呼吸變化，待呼吸等癥狀明顯時(shí)，采血，測(cè)定注射油酸后的血?dú)庵笜?biāo)。 2. 實(shí)驗(yàn)治療組 可選擇654-2或DMSO治療。用654-2治療：2mg 654-2溶于25ml生理鹽水中，耳緣靜脈注射（20min注完)，再注射油酸（劑量和程序同“油酸組”)。用DMSO治療：耳緣靜脈注射50 %DMSO 10ml/kg，20min后再注射油酸（劑量和程序同“油酸組”)。 3. 對(duì)照組 耳緣靜脈注射生理鹽水0.2ml/Kg，注射程序同 “油酸組”。 二、觀察項(xiàng)目 1．觀察各組家兔呼吸頻率及深度變化、血?dú)庵笜?biāo)的變化。待油酸組出現(xiàn)明顯癥狀，如煩躁、呼吸急促、甚至仰頭呼吸，鼻腔噴出粉紅色泡沫等，立即取血測(cè)定外周血白細(xì)胞（WBC)。 2. 外周血WBC測(cè)定 用針頭刺破各組家兔耳緣靜脈，取血測(cè)定WBC，具體步驟參照附錄。計(jì)算計(jì)數(shù)盤四角大方格WBC總和（Y)，外周血WBC = Y ′ 50 ′ 106 /L。 3．家兔左肺順應(yīng)性的測(cè)定 （1)實(shí)驗(yàn)裝置連接 如圖6-3，安裝充氣檢壓裝置，使水檢壓計(jì)一端側(cè)管與一玻璃三通管相連，一端經(jīng)橡皮管與氣管插管相連，另一端經(jīng)橡皮管與100ml注射器相連。在與注射器相連的皮管中間，再接一三通玻璃管，游離的一端接一短皮管。用止水夾控制其啟閉，以調(diào)節(jié)檢壓系統(tǒng)的壓力平衡。做充氣用的注射器內(nèi)涂少量石蠟油，以防漏氣。
圖6-3 充氣減壓裝置 （2)手術(shù) ① 用鐵錘猛擊各組家兔枕部使之猝死，仰臥位固定在兔臺(tái)上。用粗剪刀剪除頸部及胸部正中區(qū)域的毛，在頸部正中作4cm長的縱行切口，暴露氣管。 ② 用止血鉗分離氣管周圍組織，下面穿線備用。在氣管甲狀軟骨下1cm做一倒“T”切口，插入直型氣管插管并結(jié)扎固定。 ③ 然后沿胸骨右側(cè)剪開胸壁，再沿氣管分離出右主支氣管，用止血鉗夾閉右主支氣管及其肺門血管。 ④ 在左側(cè)胸壁選一肋間隙用止血鉗鈍性分離肋間肌，仔細(xì)穿破胸膜造成氣胸，使左肺萎陷（注意不要損傷肺臟)。 ⑤ 剪斷胸骨兩側(cè)的肋骨，除去胸骨，暴露肺臟。觀察各組肺的一般性狀。 （3)左肺的壓力-容積曲線測(cè)定 先把充氣檢壓裝置的注射器內(nèi)吸入50ml空氣，然后將膠管一端連于家兔之氣管插管上，此時(shí)注意檢壓計(jì)之液面是否在零位。如不在零位可打開注射器前端之T形管側(cè)管，調(diào)整水檢壓計(jì)使零點(diǎn)與肺同高，以平衡肺內(nèi)壓。以后緩慢推進(jìn)注射器向肺內(nèi)充氣，至水檢壓計(jì)讀數(shù)達(dá)2cm處，間歇10s，記錄充氣量。若在間歇期檢壓計(jì)液面有少許下移，可繼續(xù)充以少量空氣，以保持原來壓力水平。以同樣的方法，依每次遞增2cm水柱的肺內(nèi)壓向肺內(nèi)充氣，直到整個(gè)肺完全擴(kuò)張，同時(shí)記錄每次肺內(nèi)壓增加的肺內(nèi)充氣量。以充氣時(shí)的壓力變量為橫坐標(biāo)，以充氣時(shí)的容積變量為縱坐標(biāo)，繪制壓力-容積曲線。以同樣的原理立即制備抽氣時(shí)的壓力-容積曲線。對(duì)照組家兔可在左肺用生理鹽水灌洗后（見下)，再重復(fù)測(cè)定壓力-容積曲線，比較兩者的變化。 4. 左肺支氣管-肺泡灌洗、支氣管-肺泡灌洗液（broncho-alveolar-lavage fluid，BALF)WBC計(jì)數(shù)和蛋白的測(cè)定 (1) 將充氣檢壓裝置的橡皮管從氣管插管上取下，用10ml注射器抽取生理鹽水8ml，從氣管插管注入左肺內(nèi)，改變家兔體位，盡可能使生理鹽水沖洗到每一肺葉，然后將BALF回抽并倒入20ml量杯內(nèi)。重復(fù)以上述方法灌洗左肺2次，記錄灌洗液的回收量，備用。 (2) 按照本節(jié)附錄計(jì)算計(jì)數(shù)盤中四個(gè)大方格中WBC總和（Y)。BALF的WBC總數(shù)按下列公式算出：Y′50′回收液ml數(shù)′103。 (3) 用直接燒灼法定性測(cè)定BALF蛋白濃度：把各組家兔的BALF 3～4ml注入試管。在酒精燈上燒灼上方的液面，比較混濁的程度�；鞚岢潭仍礁弑硎疽后w的蛋白含量越高。 5. 灌洗液表面張力定性觀察 把灌洗液傾入50ml燒杯內(nèi)，再用另一50ml燒杯裝入生理鹽水，使其液面大致與灌洗液相仿。分別插入0.05（或0.1)ml之刻度吸管，讀出兩種液體在吸管內(nèi)的上升高度。液面上升高者表面張力大，反之表面張力小。 6. 肺系數(shù)測(cè)定 沿止血鉗上緣剪斷右主支氣管及肺門血管，取出右肺稱重計(jì)算肺系數(shù)（右肺重g′2/體重Kg)。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 制備一無損的氣管-肺標(biāo)本，是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，手術(shù)過程要細(xì)心，特別要將肺與周圍脂肪組織相區(qū)別，因其顏色近似。 2. 實(shí)驗(yàn)中要保持肺組織的濕潤。 【討論思考題】 1. 順應(yīng)性的概念，表達(dá)方法及與彈性阻力之間的關(guān)系是什么？順應(yīng)性大小與肺容積之間有無關(guān)系？ 2. 比較注氣、抽氣與作支氣管肺泡灌洗后再灌氣所得兩條壓力－容積曲線，可作出什么推論？ 3. 注入油酸后壓力-容積曲線有何變化？ 4. 耳緣靜脈注入油酸后，家兔有何癥狀出現(xiàn)？為什么？ 5. 根據(jù)血?dú)庵笜?biāo)變化，分析家兔呼吸衰竭的類型和發(fā)病機(jī)制。 6. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得資料、數(shù)據(jù)，分析油酸型RDS可能的發(fā)病機(jī)制。 附錄：WBC計(jì)數(shù) 原理：將血液或BALF用WBC稀釋液（1%鹽酸、稀龍膽紫液)稀釋，使紅細(xì)胞破壞溶解，WBC稀釋液中的龍膽紫可使WBC的核染上顏色，使WBC形態(tài)更加清晰之后進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得血液內(nèi)WBC數(shù)/mm3。 步驟： 圖6-4 細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)
1. 熟悉血細(xì)胞計(jì)數(shù)板構(gòu)造（見圖6-4) 2. 儀器洗滌 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板洗滌干凈。吸血管中的血跡應(yīng)先用自來水洗去后，再用蒸餾水洗三遍，然后吸入95%酒精洗兩次，以除去管內(nèi)的水分。最后吸入乙醚1～2次，除去酒精。每次排除管內(nèi)的洗滌液時(shí)，可用手把橡皮管摺曲，擠壓數(shù)次便可驅(qū)盡。吸血管洗凈后應(yīng)毫無血跡和水珠，其中的玻璃小珠應(yīng)能自由轉(zhuǎn)動(dòng)而不致粘在管壁上為合格。計(jì)數(shù)板在用自來水和蒸餾水相繼洗凈后，即用擦鏡紙?jiān)嚫�，切不可用酒精或乙醚洗滌，以免損壞計(jì)數(shù)板上的刻度。 3. 在低倍鏡下觀察血細(xì)胞計(jì)數(shù)室（見圖6-5) 4. 準(zhǔn)確將WBC稀釋液0.38ml加到小試管中。 5. 吸血 用WBC吸血管吸血到20 mm3，擦去尖外多余血。將血液加入到稀釋液中，混勻。 6. 將血液加入稀釋液中，混勻。 7. 充液 取蓋玻片平放在計(jì)數(shù)板上，手執(zhí)吸血管，吸取將要測(cè)定的液體，然后將吸血管口輕輕斜置于蓋玻片邊緣，滴出少量液體，此時(shí)液體由于毛細(xì)管作用而進(jìn)入計(jì)數(shù)室內(nèi)。注意：如果計(jì)數(shù)室內(nèi)留有氣泡或液體過多以至溢出室外凹溝中，都應(yīng)該洗去重新充液。 8. 計(jì)數(shù) 充液后靜置3分鐘，在低倍顯微鏡下找到“井”形大方格，計(jì)數(shù)其四個(gè)大方格的白細(xì)胞。
圖6-5 改良牛鮑爾（Neubauer)氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)室
計(jì)算計(jì)數(shù)盤中四角的四個(gè)大方格中WBC總和，再乘以50而得每立方毫米血液內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。如四個(gè)大格WBC總和為Y，則： Y/4（變?yōu)槊科椒胶撩?′10（變?yōu)榱⒎胶撩?′20（稀釋倍數(shù))=Y′50（個(gè)/ mm3) 酸堿平衡紊亂 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/B> 1. 復(fù)制動(dòng)物呼吸性酸中毒、代謝性酸中毒和代謝性堿中毒等三種類型的酸堿平衡紊亂模型。 2. 觀察三種類型酸堿平衡紊亂引起的機(jī)體機(jī)能和血?dú)庵笜?biāo)的改變。 【實(shí)驗(yàn)原理】 通過夾閉部分氣管插管模擬氣道阻塞，靜脈輸入乳酸和碳酸氫鈉等方法，造成家兔呼吸性酸中毒、代謝性酸中毒和代謝性堿中毒等三種類型的酸堿平衡紊亂模型。檢測(cè)各項(xiàng)機(jī)體功能指標(biāo)的改變和進(jìn)行動(dòng)物血?dú)夥治�，觀察三種類型的酸堿平衡紊亂對(duì)機(jī)體的影響。 【實(shí)驗(yàn)器材與藥品】 BL-420E生物機(jī)能記錄系統(tǒng)，血?dú)夥治鰞x，家兔手術(shù)臺(tái)1套，哺乳動(dòng)物手術(shù)器械1套，家兔氣管插管，動(dòng)脈插管，動(dòng)脈夾，50mL注射器2支，1mL注射器5支，頭皮針1支，直徑10mm橡皮塞5個(gè)。 3%戊巴比妥鈉，5%乳酸溶液，5%碳酸氫鈉溶液，1%肝素溶液。 【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】 家兔，雌雄不限 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一.手術(shù)操作 1．抓取家兔稱重，3%戊巴比妥鈉1mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上。 2．剪去頸部被毛， 在頸正中做4-5cm切口，分離氣管做氣管插管。連接BL-420E記錄系統(tǒng)，選擇輸入信號(hào)，經(jīng)第1通道：呼吸，描記呼吸曲線。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，穿雙線備用。 3. 耳緣靜脈注入1％肝素1mL/kg進(jìn)行全身抗凝，留置頭皮針待用。 4. 結(jié)扎頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，近心端用動(dòng)脈夾夾閉。經(jīng)盡量靠近遠(yuǎn)心端結(jié)扎處用眼科剪剪一“V”字形切口，向心方向插入動(dòng)脈插管。連接BL-420E系統(tǒng), 經(jīng)第2通道，選擇輸入信號(hào)：壓力，描記血壓曲線。 5. 用1mL注射器吸取少量1％肝素，濕潤內(nèi)壁后排出多余肝素。通過動(dòng)脈插管三通管采集動(dòng)脈血1mL，隨后迅速把注射器針頭刺入橡皮塞，并使注射器在掌中來回滾動(dòng)混勻，立即用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)庵笜?biāo)的測(cè)定。隨后觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標(biāo)并填入下表（表 6-2)。 6. 用止血鉗夾閉一側(cè)氣管插管的2/3，造成氣道阻塞。持續(xù)10min，觀測(cè)并記錄心率、呼吸幅度與頻率等指標(biāo)。采用上述方法采集動(dòng)脈血1mL，測(cè)定血?dú)庵笜?biāo)。 7. 待動(dòng)物呼吸恢復(fù)正常后，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注入5％乳酸溶液15mL/kg，同時(shí)注意觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標(biāo)。按上述方法取動(dòng)脈血1mL，測(cè)定血?dú)庵笜?biāo)。 8. 經(jīng)耳緣靜脈留置的頭皮針處，注入5％碳酸氫鈉8mL/kg。注射完畢，觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標(biāo)。按上述方法取動(dòng)脈血1mL，測(cè)定血?dú)庵笜?biāo)。 9. 經(jīng)頭皮針處，注入5％碳酸氫鈉15mL/kg。注射完畢，觀察并記錄呼吸幅度與頻率、心率、血壓等指標(biāo)。按上述方法取動(dòng)脈血1mL，測(cè)定血?dú)庵笜?biāo)。 二．觀察指標(biāo) 1.心率、血壓，呼吸幅度與頻率。 2. 血?dú)庵笜?biāo)：pH，PCO2，PO2，SB，AB，BB，BE，[K+]，[Cl-]。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 用來檢測(cè)血?dú)獾难阂欢ㄒ诳諝飧艚^，動(dòng)作要快，否則會(huì)影響結(jié)果。 2. 乳酸對(duì)血管有一定的刺激作用，在注射過程中要防止動(dòng)物掙扎。 3. 乳酸與碳酸氫鈉溶液的注入一定要緩慢，最好能維持在2mL/min。 【討論思考題】 1. 試比較三種類型的酸堿平衡紊亂在血?dú)夥矫娴母淖冇惺裁床煌�，各有何特點(diǎn)？ 2. 三種類型的酸堿平衡紊亂對(duì)呼吸與心率、血壓各有什么影響？ 表 6-2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄 類型 pH PCO2 PO2 SB AB BB BE 呼吸 心率 血壓 頻率 幅度 | 正常 呼吸性酸中毒 代謝性酸中毒 代謝性堿中毒 |
（陸麗) 實(shí)驗(yàn) 6. 7 微循環(huán)觀察及失血性休克 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/B> 1. 觀察微循環(huán)以及在失血性休克的變化； 2. 復(fù)制失血性休克的動(dòng)物模型，觀察休克發(fā)生發(fā)展過程中血壓和微循環(huán)血流等的變化，加深對(duì)于“休克發(fā)病的關(guān)鍵不在于血壓，而在于血流”的理論認(rèn)識(shí)。 3. 設(shè)計(jì)搶救方案，加深對(duì)休克防治原則及所用藥物藥理作用的理解，培養(yǎng)獨(dú)立分析問題、解決問題的能力。 【實(shí)驗(yàn)原理】 微循環(huán)是指微動(dòng)脈至微靜脈之間的血液循環(huán)。典型的微循環(huán)由微動(dòng)脈、后微動(dòng)脈、毛細(xì)血管前括約肌、毛細(xì)血管網(wǎng)、直捷通路、動(dòng)-靜脈吻合支和微靜脈等部分組成。按照微循環(huán)學(xué)說，休克發(fā)生的關(guān)鍵是微循環(huán)灌流障礙；根據(jù)病情進(jìn)展，微循環(huán)變化可分為缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循環(huán)衰竭期。 導(dǎo)致休克的原因有多種，其始動(dòng)環(huán)節(jié)都是血容量急性降低、急性心泵功能障礙和血管容量迅速擴(kuò)大。家兔的血容量可按體重（g)乘以8%來估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，機(jī)體通過代償機(jī)制可不表現(xiàn)癥狀；出血量達(dá)20~30%，動(dòng)物發(fā)生休克；出血量達(dá)50%，動(dòng)物死亡。 失血性休克的臨床表現(xiàn)是血壓明顯下降、皮膚蒼白、四肢冰冷、尿量減少、中心靜脈壓下降, 此外還有心率、呼吸增快等。 搶救休克的原則是去除病因、擴(kuò)容、糾酸、合理使用血管活性物質(zhì)、使用藥物保護(hù)細(xì)胞以及防止器官衰竭。據(jù)此，同學(xué)們可自行設(shè)計(jì)搶救方案。 【實(shí)驗(yàn)器材和藥品】 BL-420E生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，兔手術(shù)臺(tái)，壓力換能器，呼吸流量換能器，BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，恒溫灌流盒，哺乳動(dòng)物手術(shù)器械1套，靜脈輸液及中心靜脈壓測(cè)量裝置1套，連接放血、儲(chǔ)血裝置1套，膀胱插管及計(jì)滴器裝置1套； 注射器數(shù)支，試管2支，小燒杯1個(gè)，線繩（黑色、白色粗線)若干。 3％戊巴比妥鈉，生理鹽水，0.3％肝素，臺(tái)氏液，中分子右旋糖苷，去甲腎上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理鹽水。 【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】 家兔 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一．動(dòng)物準(zhǔn)備和手術(shù) 1. 動(dòng)物稱重，麻醉，固定 正確捉拿家兔1只，稱重，耳緣靜脈緩慢注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg使動(dòng)物麻醉，麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)：四肢肌緊張減低，角膜反射消失，呼吸深而平穩(wěn)。 將家兔仰臥于兔手術(shù)臺(tái)上，固定四肢及頭部。 2．頸部手術(shù) 剪去頸部正中的被毛，作長約5~7cm的正中切口，鈍性分離皮下組織。頸部手術(shù)分離氣管、右側(cè)頸外靜脈、左側(cè)頸總動(dòng)脈。依次進(jìn)行： （1)氣管插管 氣管插管的一側(cè)側(cè)管連接呼吸流量換能器，記錄呼吸。 （2)頸外靜脈插管 目的是：①建立靜脈輸液或給藥途徑；②測(cè)量中心靜脈壓，當(dāng)插管接近右心房，可見液面隨呼吸而波動(dòng)。插管完成后，慢速點(diǎn)滴生理鹽水（5~10滴/min)，以保持插管的通暢以及維持尿的生成。 （3)左側(cè)頸總動(dòng)脈插管 通過“三通”連接血壓傳感器和放血用儲(chǔ)血瓶。 3．下腹部手術(shù) 膀胱插管。請(qǐng)參照第三章相關(guān)內(nèi)容。 4．全身血液肝素化 耳緣靜注射肝素（625u/ml)，劑量為1ml/kg，此后每隔1h注射1ml維持。 5．連接BL-420E生物信號(hào)系統(tǒng)（見圖6-6)， 1通道測(cè)量血壓連接動(dòng)脈插管壓力換能器、2通道測(cè)量呼吸連接呼吸流量換能器、3通道作尿量計(jì)滴連接計(jì)滴器，分別調(diào)整適當(dāng)?shù)膮?shù)描記血壓、呼吸和尿量。
圖 6-6 兔失血性休克示意圖 二．組織（微循環(huán))血流觀察項(xiàng)目及指標(biāo) 1. 皮膚粘膜血管和尿量 觀察球結(jié)合膜血管口徑及血流；提起耳殼，對(duì)光透現(xiàn)血管口徑及血流；用計(jì)滴器記錄尿量，若家兔無尿，通過頸外靜脈緩慢滴入少量生理鹽水，使家兔尿量維持在6~8滴/min。 2. 正常家兔腸系膜微循環(huán)活體鏡檢觀察 在左腹直肌旁作6cm縱行的切口腹壁，鈍性分離肌肉；打開腹腔后，將卵圓孔外科腸鉗伸入左下腹側(cè)（緊貼前腹壁)；鉗出一段小腸袢（一般是闌尾末端上8~12cm處的回腸袢)，平展并固定于恒溫微循環(huán)灌流盒內(nèi)，以38°C臺(tái)氏液恒溫灌流；用微循環(huán)顯微鏡連接BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，觀察家兔小腸系膜微循環(huán)變化。 首先在鏡下確認(rèn)粗、細(xì)有別，血流方向相反的微動(dòng)脈、微靜脈和僅能讓一個(gè)紅細(xì)胞通過的毛細(xì)血管。微動(dòng)脈的血流速度較快，靜脈內(nèi)血色較暗。然后，固定某一區(qū)域，連續(xù)觀察毛細(xì)血管袢數(shù)目、血流速度、血流量及血管口徑（可用測(cè)微器或?qū)ｉT儀器)改變。 三．復(fù)制失血性休克動(dòng)物模型 觀察記錄正常血壓、呼吸、尿量等指標(biāo)和微循環(huán)血流的變化。復(fù)制失血性休克時(shí)，撥動(dòng)“三通”停止輸液，連通水檢壓計(jì)和靜脈插管，可見水檢壓計(jì)的液面下降。當(dāng)液面不再下降并隨呼吸而波動(dòng)，即為中心靜脈壓（CVP)，記錄數(shù)據(jù)。分別進(jìn)行： 1．少量失血 撥動(dòng)連接動(dòng)脈插管、壓力換能器和儲(chǔ)血瓶的“三通”，使血液（約10ml)從頸總動(dòng)脈流入預(yù)先注有10ml 0.3％肝素的儲(chǔ)血瓶，恢復(fù)“三通”原來的位置，觀察皮膚粘膜、血壓、呼吸、尿量和微循環(huán)的變化。（全血量按體重的8%計(jì)算，或70ml/kg，10ml血液約占血容量百分之幾？)。 2. 大量失血：少量失血10分鐘后，待家兔血壓代償性恢復(fù)正常，再打開“三通”，在3~5min（切勿過快)內(nèi)讓失血量達(dá)全血量20%~25%，觀察上述指標(biāo)的變化。要求血壓下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不應(yīng)低于4kPa(30mmHg)。如果血壓回升，可再放一定量的血。使整個(gè)觀察期內(nèi)血壓始終維持在4~5.32kPa水平，即失血性休克狀態(tài)。 兩次失血后都應(yīng)觀察記錄如下指標(biāo)的變化： ⑴實(shí)驗(yàn)兔一般情況，皮膚粘膜、球（瞼)結(jié)合膜血管口徑及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循環(huán)的變化：大量失血后，毛細(xì)血管口徑縮小，失血性休克持續(xù)一段時(shí)間后，毛細(xì)血管血流速度和血流量逐漸下降，部分微血管內(nèi)（尤其在微靜脈)可見白細(xì)胞附壁翻滾。 四．實(shí)驗(yàn)性治療 根據(jù)失血性休克的病理生理變化，按休克發(fā)病學(xué)的防治原則（擴(kuò)容、糾酸、應(yīng)用血管活性藥物和防治細(xì)胞損傷等)治療，從下列藥物中自行設(shè)計(jì)3種搶救方案（其中必須包括去甲腎上腺素)。藥物可從靜脈途徑輸入，觀察并比較各項(xiàng)救治措施后血壓、CVP和尿量等指標(biāo)以及微循環(huán)的變化。 ⑴ 去甲腎上腺素：0.2mg溶于10ml生理鹽水中，5min內(nèi)靜脈滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理鹽水（輸液的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（輸入的量一般為失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理鹽水中，靜脈滴注（20min輸完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：靜脈滴入（輸入的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑹ 0.01%異丙腎上腺素1ml，靜脈注射； ⑺ 全血：將放出的血液經(jīng)抗凝后全部倒入輸液瓶內(nèi)，快速輸回。緊急情況下，可考慮經(jīng)動(dòng)脈逆行（向心臟方向)快速注入。 搶救治療后，再復(fù)查動(dòng)物一般情況，觀察上述各項(xiàng)指標(biāo)的變化。 五．處死動(dòng)物 耳緣靜脈注射空氣5~10ml。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，均需保持動(dòng)脈靜脈插管與血管平行，以免刺破血管。 2. 保護(hù)耳緣靜脈，注射時(shí)應(yīng)先從耳遠(yuǎn)端進(jìn)針，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分離時(shí)要盡可能剔除脂肪和結(jié)締組織。 4. 排空后的膀胱壁較厚，應(yīng)選擇血管最少的部位剪開插管，插管前一定要把膀胱壁各層（漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜)剪破。 5. 本實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作多，應(yīng)盡量減少手術(shù)性出血和休克，如手術(shù)過程中失血過多時(shí)可先插頸外靜脈輸液。 6. 動(dòng)脈插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充滿肝素生理鹽水，排出氣泡；靜脈插管一經(jīng)插入，應(yīng)立刻緩慢滴注生理鹽水，以防凝血。輸液量不能過多，以免導(dǎo)致肺水腫等合并癥。 7. 正確旋轉(zhuǎn)“三通”。 8. 先停止輸液，再進(jìn)行失血性的實(shí)驗(yàn)；在整個(gè)失血性實(shí)驗(yàn)過程，不再輸液，觀察中心靜脈壓的變化。 9. 注意分工合作，保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面整潔。 【討論思考題】 1. 討論實(shí)驗(yàn)動(dòng)物失血前、后各項(xiàng)指標(biāo)變化的機(jī)理，什么證據(jù)說明家兔己發(fā)生了失血性休克？請(qǐng)闡明微循環(huán)處于什么階段以及理由。 2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所見指標(biāo)能否完全闡明關(guān)于休克發(fā)生機(jī)制的現(xiàn)代理論？為什么？ 3. 在失血性休克中，血壓的變化和微循環(huán)的變化是否一致？為什么？ 4. 抗休克藥的作用機(jī)制是否相同？ 附：實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄參考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其搶救過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵結(jié)膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 實(shí)驗(yàn)前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 輸血 …
微循環(huán)觀察及失血性休克 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/B> 1. 觀察微循環(huán)以及在失血性休克的變化； 2. 復(fù)制失血性休克的動(dòng)物模型，觀察休克發(fā)生發(fā)展過程中血壓和微循環(huán)血流等的變化，加深對(duì)于“休克發(fā)病的關(guān)鍵不在于血壓，而在于血流”的理論認(rèn)識(shí)。 3. 設(shè)計(jì)搶救方案，加深對(duì)休克防治原則及所用藥物藥理作用的理解，培養(yǎng)獨(dú)立分析問題、解決問題的能力。 【實(shí)驗(yàn)原理】 微循環(huán)是指微動(dòng)脈至微靜脈之間的血液循環(huán)。典型的微循環(huán)由微動(dòng)脈、后微動(dòng)脈、毛細(xì)血管前括約肌、毛細(xì)血管網(wǎng)、直捷通路、動(dòng)-靜脈吻合支和微靜脈等部分組成。按照微循環(huán)學(xué)說，休克發(fā)生的關(guān)鍵是微循環(huán)灌流障礙；根據(jù)病情進(jìn)展，微循環(huán)變化可分為缺血性缺氧期、淤血性缺氧期和微循環(huán)衰竭期。 導(dǎo)致休克的原因有多種，其始動(dòng)環(huán)節(jié)都是血容量急性降低、急性心泵功能障礙和血管容量迅速擴(kuò)大。家兔的血容量可按體重（g)乘以8%來估算（ml)。急性出血，出血量在血容量的10%以下，機(jī)體通過代償機(jī)制可不表現(xiàn)癥狀；出血量達(dá)20~30%，動(dòng)物發(fā)生休克；出血量達(dá)50%，動(dòng)物死亡。 失血性休克的臨床表現(xiàn)是血壓明顯下降、皮膚蒼白、四肢冰冷、尿量減少、中心靜脈壓下降, 此外還有心率、呼吸增快等。 搶救休克的原則是去除病因、擴(kuò)容、糾酸、合理使用血管活性物質(zhì)、使用藥物保護(hù)細(xì)胞以及防止器官衰竭。據(jù)此，同學(xué)們可自行設(shè)計(jì)搶救方案。 【實(shí)驗(yàn)器材和藥品】 BL-420E生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，兔手術(shù)臺(tái)，壓力換能器，呼吸流量換能器，BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，恒溫灌流盒，哺乳動(dòng)物手術(shù)器械1套，靜脈輸液及中心靜脈壓測(cè)量裝置1套，連接放血、儲(chǔ)血裝置1套，膀胱插管及計(jì)滴器裝置1套； 注射器數(shù)支，試管2支，小燒杯1個(gè)，線繩（黑色、白色粗線)若干。 3％戊巴比妥鈉，生理鹽水，0.3％肝素，臺(tái)氏液，中分子右旋糖苷，去甲腎上腺素，654-2，7.5%NaCl溶液，5%葡萄糖生理鹽水。 【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】 家兔 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一．動(dòng)物準(zhǔn)備和手術(shù) 1. 動(dòng)物稱重，麻醉，固定 正確捉拿家兔1只，稱重，耳緣靜脈緩慢注射3％戊巴比妥鈉1ml/kg使動(dòng)物麻醉，麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)：四肢肌緊張減低，角膜反射消失，呼吸深而平穩(wěn)。 將家兔仰臥于兔手術(shù)臺(tái)上，固定四肢及頭部。 2．頸部手術(shù) 剪去頸部正中的被毛，作長約5~7cm的正中切口，鈍性分離皮下組織。頸部手術(shù)分離氣管、右側(cè)頸外靜脈、左側(cè)頸總動(dòng)脈。依次進(jìn)行： （1)氣管插管 氣管插管的一側(cè)側(cè)管連接呼吸流量換能器，記錄呼吸。 （2)頸外靜脈插管 目的是：①建立靜脈輸液或給藥途徑；②測(cè)量中心靜脈壓，當(dāng)插管接近右心房，可見液面隨呼吸而波動(dòng)。插管完成后，慢速點(diǎn)滴生理鹽水（5~10滴/min)，以保持插管的通暢以及維持尿的生成。 （3)左側(cè)頸總動(dòng)脈插管 通過“三通”連接血壓傳感器和放血用儲(chǔ)血瓶。 3．下腹部手術(shù) 膀胱插管。請(qǐng)參照第三章相關(guān)內(nèi)容。 4．全身血液肝素化 耳緣靜注射肝素（625u/ml)，劑量為1ml/kg，此后每隔1h注射1ml維持。 5．連接BL-420E生物信號(hào)系統(tǒng)（見圖6-6)， 1通道測(cè)量血壓連接動(dòng)脈插管壓力換能器、2通道測(cè)量呼吸連接呼吸流量換能器、3通道作尿量計(jì)滴連接計(jì)滴器，分別調(diào)整適當(dāng)?shù)膮?shù)描記血壓、呼吸和尿量。
圖 6-6 兔失血性休克示意圖 二．組織（微循環(huán))血流觀察項(xiàng)目及指標(biāo) 1. 皮膚粘膜血管和尿量 觀察球結(jié)合膜血管口徑及血流；提起耳殼，對(duì)光透現(xiàn)血管口徑及血流；用計(jì)滴器記錄尿量，若家兔無尿，通過頸外靜脈緩慢滴入少量生理鹽水，使家兔尿量維持在6~8滴/min。 2. 正常家兔腸系膜微循環(huán)活體鏡檢觀察 在左腹直肌旁作6cm縱行的切口腹壁，鈍性分離肌肉；打開腹腔后，將卵圓孔外科腸鉗伸入左下腹側(cè)（緊貼前腹壁)；鉗出一段小腸袢（一般是闌尾末端上8~12cm處的回腸袢)，平展并固定于恒溫微循環(huán)灌流盒內(nèi)，以38°C臺(tái)氏液恒溫灌流；用微循環(huán)顯微鏡連接BI2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，觀察家兔小腸系膜微循環(huán)變化。 首先在鏡下確認(rèn)粗、細(xì)有別，血流方向相反的微動(dòng)脈、微靜脈和僅能讓一個(gè)紅細(xì)胞通過的毛細(xì)血管。微動(dòng)脈的血流速度較快，靜脈內(nèi)血色較暗。然后，固定某一區(qū)域，連續(xù)觀察毛細(xì)血管袢數(shù)目、血流速度、血流量及血管口徑（可用測(cè)微器或?qū)ｉT儀器)改變。 三．復(fù)制失血性休克動(dòng)物模型 觀察記錄正常血壓、呼吸、尿量等指標(biāo)和微循環(huán)血流的變化。復(fù)制失血性休克時(shí)，撥動(dòng)“三通”停止輸液，連通水檢壓計(jì)和靜脈插管，可見水檢壓計(jì)的液面下降。當(dāng)液面不再下降并隨呼吸而波動(dòng)，即為中心靜脈壓（CVP)，記錄數(shù)據(jù)。分別進(jìn)行： 1．少量失血 撥動(dòng)連接動(dòng)脈插管、壓力換能器和儲(chǔ)血瓶的“三通”，使血液（約10ml)從頸總動(dòng)脈流入預(yù)先注有10ml 0.3％肝素的儲(chǔ)血瓶，恢復(fù)“三通”原來的位置，觀察皮膚粘膜、血壓、呼吸、尿量和微循環(huán)的變化。（全血量按體重的8%計(jì)算，或70ml/kg，10ml血液約占血容量百分之幾？)。 2. 大量失血：少量失血10分鐘后，待家兔血壓代償性恢復(fù)正常，再打開“三通”，在3~5min（切勿過快)內(nèi)讓失血量達(dá)全血量20%~25%，觀察上述指標(biāo)的變化。要求血壓下降至5.32kPa(40mmHg)左右，不應(yīng)低于4kPa(30mmHg)。如果血壓回升，可再放一定量的血。使整個(gè)觀察期內(nèi)血壓始終維持在4~5.32kPa水平，即失血性休克狀態(tài)。 兩次失血后都應(yīng)觀察記錄如下指標(biāo)的變化： ⑴實(shí)驗(yàn)兔一般情況，皮膚粘膜、球（瞼)結(jié)合膜血管口徑及血流； ⑵CVP、BP、心率、呼吸、尿量； ⑶微循環(huán)的變化：大量失血后，毛細(xì)血管口徑縮小，失血性休克持續(xù)一段時(shí)間后，毛細(xì)血管血流速度和血流量逐漸下降，部分微血管內(nèi)（尤其在微靜脈)可見白細(xì)胞附壁翻滾。 四．實(shí)驗(yàn)性治療 根據(jù)失血性休克的病理生理變化，按休克發(fā)病學(xué)的防治原則（擴(kuò)容、糾酸、應(yīng)用血管活性藥物和防治細(xì)胞損傷等)治療，從下列藥物中自行設(shè)計(jì)3種搶救方案（其中必須包括去甲腎上腺素)。藥物可從靜脈途徑輸入，觀察并比較各項(xiàng)救治措施后血壓、CVP和尿量等指標(biāo)以及微循環(huán)的變化。 ⑴ 去甲腎上腺素：0.2mg溶于10ml生理鹽水中，5min內(nèi)靜脈滴注； ⑵ 5％葡萄糖生理鹽水（輸液的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑶ 7.5%NaCl溶液（輸入的量一般為失血量的1/3)； ⑷ 654-2：2mg溶于25ml生理鹽水中，靜脈滴注（20min輸完)； ⑸ 中分子右旋糖苷：靜脈滴入（輸入的量應(yīng)根據(jù)失血量自行確定)； ⑹ 0.01%異丙腎上腺素1ml，靜脈注射； ⑺ 全血：將放出的血液經(jīng)抗凝后全部倒入輸液瓶內(nèi)，快速輸回。緊急情況下，可考慮經(jīng)動(dòng)脈逆行（向心臟方向)快速注入。 搶救治療后，再復(fù)查動(dòng)物一般情況，觀察上述各項(xiàng)指標(biāo)的變化。 五．處死動(dòng)物 耳緣靜脈注射空氣5~10ml。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，均需保持動(dòng)脈靜脈插管與血管平行，以免刺破血管。 2. 保護(hù)耳緣靜脈，注射時(shí)應(yīng)先從耳遠(yuǎn)端進(jìn)針，如不成功，再向耳根部移位。 3. 血管分離時(shí)要盡可能剔除脂肪和結(jié)締組織。 4. 排空后的膀胱壁較厚，應(yīng)選擇血管最少的部位剪開插管，插管前一定要把膀胱壁各層（漿膜、肌層、粘膜下層和粘膜)剪破。 5. 本實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作多，應(yīng)盡量減少手術(shù)性出血和休克，如手術(shù)過程中失血過多時(shí)可先插頸外靜脈輸液。 6. 動(dòng)脈插管前，要把家兔肝素化；插管前要把插管先充滿肝素生理鹽水，排出氣泡；靜脈插管一經(jīng)插入，應(yīng)立刻緩慢滴注生理鹽水，以防凝血。輸液量不能過多，以免導(dǎo)致肺水腫等合并癥。 7. 正確旋轉(zhuǎn)“三通”。 8. 先停止輸液，再進(jìn)行失血性的實(shí)驗(yàn)；在整個(gè)失血性實(shí)驗(yàn)過程，不再輸液，觀察中心靜脈壓的變化。 9. 注意分工合作，保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面整潔。 【討論思考題】 1. 討論實(shí)驗(yàn)動(dòng)物失血前、后各項(xiàng)指標(biāo)變化的機(jī)理，什么證據(jù)說明家兔己發(fā)生了失血性休克？請(qǐng)闡明微循環(huán)處于什么階段以及理由。 2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所見指標(biāo)能否完全闡明關(guān)于休克發(fā)生機(jī)制的現(xiàn)代理論？為什么？ 3. 在失血性休克中，血壓的變化和微循環(huán)的變化是否一致？為什么？ 4. 抗休克藥的作用機(jī)制是否相同？ 附：實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄參考表（表6-6)。 表 6-6 失血性休克及其搶救過程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化 BP CVP 心 率 呼 吸 尿 量 耳朵結(jié)膜血管 (mmHg) (cmH2O) (次/min) 次/min 深度 （滴/min) 實(shí)驗(yàn)前 小量失血 大失血 NE 7.5%NaCl 輸血 …
(梁仲培) 心功能的影響因素與實(shí)驗(yàn)性心力衰竭 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/B> 1. 學(xué)習(xí)離體在位蟾蜍心臟的恒壓灌流法，觀察前、后負(fù)荷和心肌收縮性能對(duì)心功能的影響，并描繪心功能曲線的變化； 2. 制備實(shí)驗(yàn)性全心衰的動(dòng)物模型；觀察強(qiáng)心藥物對(duì)衰竭心肌的治療作用。 【實(shí)驗(yàn)原理】 一般作為衡量心功能的指標(biāo)是心輸出量（心輸出量ml/min=每搏輸出量ml/次×心率 次/min)。在此次實(shí)驗(yàn)中利用離體在位的蟾蜍心臟，消除了神經(jīng)反射對(duì)心率變動(dòng)的影響，所以相當(dāng)于在心率基本恒定的情況下，主要考慮每搏輸出量對(duì)心輸出量的影響。前者反映了心肌舒縮力量與作功的大小，它受前、后負(fù)荷和心肌收縮性等基本因素的影響。在一定范圍內(nèi)，回心血量增加，心室舒張末期容積（前負(fù)荷)增加，使心肌纖維初長度拉長，心肌收縮力加強(qiáng)，每搏輸出量增加，即F-Starling定律。當(dāng)心室后負(fù)荷（如大動(dòng)脈壓)增加時(shí)，即心室收縮射血克服阻抗增加，心室壁收縮期張力增大，作功增加。心肌收縮性能改變是指心肌內(nèi)在收縮機(jī)制改變所引起的收縮力量的改變，與前、后負(fù)荷無關(guān)，而可受去甲腎上腺素、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)和體液因素的影響。改變心肌收縮性能可使心功曲線左移或右移。 本實(shí)驗(yàn)利用硫酸鎘競爭性抑制Ca2+內(nèi)流，降低心肌收縮性制備出全心衰模型。 洋地黃因使心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性減低，異丙腎上腺素則作為膜β受體激動(dòng)劑，對(duì)衰竭心肌都有一定治療作用，而普奈洛爾作為β受體阻斷劑，可拮抗β受體激動(dòng)劑的強(qiáng)心作用。 【實(shí)驗(yàn)器材與藥品】 蛙類手術(shù)器械一套，恒壓灌流裝置一套，10ml量筒，小燒懷，動(dòng)、靜脈插管，計(jì)算，器滴管，坐標(biāo)紙，任氏液，1:10,000去甲腎上腺素，1:10,000乙酰膽堿，2×10－6～2×10－5mol/L硫酸鎘任氏液，0.2％地高辛，0.2%普奈洛爾（按片劑重量計(jì)算)，0.001%異丙腎上腺素。 【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】 蟾蜍或蛙 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一.離體在位心臟灌流標(biāo)本的制備 1. 破壞蛙腦和脊髓，將其仰臥放在蛙板上，用外科剪于劍突處向兩側(cè)鎖骨肩峰端呈三角形剪開皮膚，用粗剪剪開胸壁，切勿損傷心臟，剪去胸骨、鎖骨，用蛙釘把兩前肢固定在蛙板上。用鑷子提起心包膜，用眼科剪仔細(xì)將其剪開，暴露心臟。 2. 分離出左、右主動(dòng)脈，在其下方穿兩根線備用。用玻璃分針將心臟翻向頭側(cè)，可看到靜脈竇與下腔靜脈（后腔靜脈)。小心分離并剪開與下腔靜脈相連的心包膜組織在其下穿一根線備用。 將剛才穿于主動(dòng)脈下的其中一根備用線從下腔靜脈下繞過，結(jié)扎此線，便把兩主動(dòng)脈和下腔靜脈以外的全部血管扎住，結(jié)扎過程中切勿扎到靜脈竇。再把穿于主動(dòng)脈下方的另一根線結(jié)扎右主動(dòng)脈（見圖6-7)。 3. 用鑷子夾住下腔靜脈的上壁少許，用剪刀沿鑷子下緣剪一小口，將事先充滿任氏液（不含氣泡)的靜脈插管插入此切口，直至靜脈竇內(nèi)，用備用線結(jié)扎固定。翻轉(zhuǎn)心臟向下，提起左主動(dòng)脈，在左主動(dòng)脈盡量長的遠(yuǎn)端剪一斜形切口，然后用充滿任氏液的吸管插入心室，沖洗并反復(fù)數(shù)次（目的是避免血液堵塞插管)。注意不要進(jìn)氣泡。 4、將事先充滿任氏液的動(dòng)脈插管向心性插入，作為心搏出口，并用線結(jié)扎固定。 5、把靜脈插管與橡皮管1相連，但先不打開夾子；把動(dòng)脈插管與橡皮管2相連（見圖6-8)。
圖 6-7 蛙心臟示意圖（a、b、c分別為結(jié)扎線) 圖 6-8 離體蛙心恒壓灌流裝置 二. 觀察項(xiàng)目 1. 每分輸出量和有效心功率的計(jì)算方法 （1)每分輸出量：用小燒杯收集心臟搏出的灌流液1分鐘，用小量筒測(cè)定搏出液量（ml)。同時(shí)計(jì)數(shù)心率（次/分)。 （2)計(jì)算： 有效心功率 = 心輸出量 ′ 心功管高度（側(cè)管高度)′ 水密度 （g×cm/min) （ml/min) （cm) （1g/ml) （3)肉眼觀察心舒張容積、心肌收縮力量變化。 2. 觀察實(shí)驗(yàn)因素對(duì)每分輸出量和有效心功率的影響 （1)改變前負(fù)荷（后負(fù)荷固定)：把皮管2固定在約高于心臟3cm的水平，調(diào)節(jié)貯液瓶高度，使“零點(diǎn)”分別處于5cm、10cm、15cm……等高度，觀察心舒容積和心肌收縮力量的變化，同時(shí)分別依次測(cè)定各高度下的心輸出量、心率、每搏輸出量并即時(shí)算出有效心功率。若有效心功率曲線平移時(shí)，便恢復(fù)“零點(diǎn)”在5cm的水平。找出最適前負(fù)荷（即心臟不過分充盈擴(kuò)張而心輸出量又較高的“零點(diǎn)”高度)。注意：“零點(diǎn)”在5cm時(shí)，搏出量應(yīng)保持在20~30滴/分（在橡皮管1處用螺旋止水夾控制)。以下個(gè)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中所取的固定前負(fù)荷=最適前負(fù)荷-5cm。 （2)改變后負(fù)荷（前負(fù)荷固定)：把前負(fù)荷固定在“固定前負(fù)荷”，改變橡皮管2的高度（每次間距為5cm)觀察并記錄上述（1)中各項(xiàng)指標(biāo)。 注意：在實(shí)驗(yàn)過程中，每改變一次側(cè)管高度，要穩(wěn)定1~2分鐘，再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)側(cè)管高度超過心臟代償范圍至有效心功率曲線平移或下降（即心衰)時(shí)，就不能再提高側(cè)管高度�；謴�(fù)皮管2約高于心臟3 cm水平，待心輸出量基本達(dá)到本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前的水平并以此作為對(duì)照，進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)。（下面的各次實(shí)驗(yàn)也遵循此原則)。 （3)心肌收縮性能改變：將前后負(fù)荷固定，用滴管將1:10,000去甲腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，按上法滴加1:10,000乙酰膽堿1~2滴滴于心臟表面，觀察和記錄上述指標(biāo)的變化。 （4)異丙腎上腺素：用任氏液沖洗心臟表面，把乙酰膽堿沖洗干凈，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 （5)普奈洛爾：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，按上法滴加0.2%普奈洛爾2~3滴滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化,待出現(xiàn)作用時(shí)，立即重復(fù)（4)步驟操作。 （6)硫酸鎘：用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)后，用2′10-6mol/L硫酸鎘任氏液代替任氏液灌流心臟，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 （7)強(qiáng)心甙藥物：在用硫酸鎘灌流的心臟出現(xiàn)心衰表現(xiàn)后（心輸出量和有效心功率明顯下降)，用滴管滴加0.2%毒毛旋花子素K（或0.2% 地戈辛)1~2滴于心臟表面，觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。用任氏液沖洗心臟表面，待心臟活動(dòng)恢復(fù)或接近給予強(qiáng)心甙藥物前狀態(tài)后，用滴管將0.001%異丙腎上腺素1~2滴均勻滴加于心臟表面，待1~2min觀察和記錄心率、心輸出量和有效心功率的變化。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 實(shí)驗(yàn)過程中勿用手捏拿心臟，以免損傷心臟。 2. 心臟表面應(yīng)經(jīng)常滴加任氏液，以保持濕潤。 3. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，管道不要扭曲。 4. 實(shí)驗(yàn)過程中，應(yīng)回收、循環(huán)使用任氏液或硫酸鎘任氏液。 【討論思考題】 1. 評(píng)價(jià)心功能指標(biāo)有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？ 2. 影響心功能的因素有哪些？從心臟本身來分析，那些因素可影響心功能？ 3. 強(qiáng)心苷對(duì)心臟有何作用？中毒表現(xiàn)如何？為什么？ 4. 臨床上左、右心衰表現(xiàn)各如何？治療原則及藥物選擇各如何？ 急性肝功能不全及氨在肝性腦病發(fā)病中的作用 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/B> 1. 急性阻斷肝臟血流造成急性肝功能損傷模型，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化； 2. 對(duì)經(jīng)不同處理的實(shí)驗(yàn)家兔灌入氯化銨溶液或生理鹽水，觀察出現(xiàn)相應(yīng)癥狀的所需的氯化銨用量，測(cè)定各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后的血氨水平，探討氨在肝性腦病發(fā)病機(jī)制中的作用； 3. 通過各組動(dòng)物的不同處理，進(jìn)一步加深對(duì)醫(yī)學(xué)研究設(shè)計(jì)的理解。 【實(shí)驗(yàn)原理】 正常情況下，肝細(xì)胞通過鳥氨酸循環(huán)把2個(gè)氨分子合成為1個(gè)尿素分子，再由腎臟排出體外，使血氨的來源和清除保持動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)人為地阻斷肝臟的血流，造成肝細(xì)胞功能急性損傷，從而使谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)活性升高，鳥氨酸循環(huán)障礙。 肝性腦病是繼發(fā)于嚴(yán)重肝功能損害的精神神經(jīng)綜合癥。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前有氨中毒學(xué)說、假性神經(jīng)介質(zhì)學(xué)說、血漿氨基酸失衡學(xué)說、g-GABA學(xué)說和綜合學(xué)說等。氨中毒學(xué)說中心內(nèi)容是肝性腦病的發(fā)生與血氨升高密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在人為地阻斷肝臟的血流、造成肝功能急性損傷的同時(shí)，再經(jīng)消化道灌入復(fù)方氯化銨溶液，使血氨水平明顯升高，產(chǎn)生類似肝性腦病的臨床表現(xiàn)。 【實(shí)驗(yàn)器材和藥品】 哺乳動(dòng)物手術(shù)器械1套，兔臺(tái)，胃管（用人的導(dǎo)尿管代替)，粗棉線1根，三角縫針和小圓針各1根，血氨測(cè)定用的器材1套；5ml試管10支，離心機(jī)，恒溫水浴箱，722型分光光度計(jì)； 1%普魯卡因，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4), 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液, 2,4-二硝基苯肼溶液，0.4mmol/L NaOH溶液, 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2mmol/ml)； 2.5%復(fù)方氯化銨溶液（5%葡萄糖溶液100ml中加入氯化銨2.5g，碳酸氫鈉1.5g)，生理鹽水，無氨水； 10%鎢酸鈉，硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液，0.5mmol/L硫酸，顯色Ⅰ液，顯色Ⅱ液；（供血濾液直接測(cè)定血氨法用，若用血氨測(cè)定試劑盒則不必準(zhǔn)備)； 血氨測(cè)定試劑盒，尿素測(cè)定試劑盒。 【實(shí)驗(yàn)對(duì)象】 家兔 【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】 一．從耳中央動(dòng)脈取血制備血清 將家兔置于兔固定箱內(nèi)，在兔耳的中央有一條較粗、顏色較鮮紅的中央動(dòng)脈，用左手固定兔耳，右手取注射器，在中央動(dòng)脈的末端，沿著動(dòng)脈平行地向心方向刺入動(dòng)脈，即可見動(dòng)脈血進(jìn)入針筒，取血3ml制備血清備用。取血完畢后注意止血。由于兔耳中央動(dòng)脈容易痙攣，故抽血前必須讓兔耳充分充血，采血時(shí)動(dòng)作要迅速。采血所用針頭不要太細(xì)，一般用6號(hào)針頭。 二．急性肝功能不全動(dòng)物模型的制備及分組 1. 手術(shù) 取家兔3只，進(jìn)行如下操作： ⑴ 將家兔稱重后，固定于兔臺(tái)上。剪去上腹部被毛，在正中切口部位用0.1%普魯卡因5ml作皮下浸潤麻醉；切開皮膚，長約5~6cm；再沿腹白線切開腹壁進(jìn)入腹腔，可見肝等內(nèi)臟。 ⑵ 結(jié)扎肝門區(qū)血管：用手輕壓肝表面，在肝和膈肌之間可見一透明、呈三角形的鐮狀韌帶。小心用眼科剪將其剪斷（切莫損傷膈肌)。 ⑶ 將3只家兔分為甲、乙、丙3組。甲和丙組把粗棉線放置于家兔肝門區(qū)，除右外葉和尾葉外，將肝左外側(cè)葉、左中葉和右中葉翻出并用力結(jié)扎。使大部分肝血流阻斷，因而模擬急性肝功能不全。乙兔不結(jié)扎肝葉，肝功能正常。 ⑷ 十二指腸插管：沿胃幽門向下找出一段十二指腸，用帶有絲線的小圓針穿越腸壁4～5針，圍成一個(gè)小圓圈。再用眼科剪在圓圈內(nèi)血管少的腸壁作一小切口，將胃管順十二指腸遠(yuǎn)端方向插入腸腔5cm。結(jié)扎并固定胃管后，用三角縫針將腹壁做連鎖縫合，關(guān)閉腹壁，把家兔松開。 2. 實(shí)驗(yàn)觀察 觀察家兔的一般狀況、呼吸、肌張力、角膜反射和痛覺反射等指標(biāo)后，小腸插管家兔小腸內(nèi)每隔5min灌入如下溶液：甲和乙兔灌入2.5%復(fù)方氯化銨溶液3ml/kg；丙兔灌入生理鹽水3ml/kg。每次灌藥前觀察上述指標(biāo)的變化。 甲兔灌入復(fù)方氯化銨溶液后呼吸逐漸變得深快或深大，肌張力減弱、頸軟、頭垂、四肢無力、痛覺反射和角膜反射遲鈍，灌藥5~6次左右，甲兔痙攣抽搐、角弓反張。請(qǐng)實(shí)驗(yàn)者一邊觀察，一邊思考癥狀為什么會(huì)出現(xiàn)。 三. 谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血氨和尿素氮的檢測(cè) 在甲兔第一次痙攣抽搐發(fā)作時(shí)，固定甲兔于兔臺(tái)上，先從耳中央動(dòng)脈取血3ml制備血清備用；再用抗凝注射器心臟采血5ml，作血氨和尿素氮（BUN)的測(cè)定。 1. 按附錄的方法測(cè)定家兔實(shí)驗(yàn)前后血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)的活力。 2. 血氨和血尿素氮（BUN)的測(cè)定：分別按試劑盒方法或附錄的方法測(cè)定血氨（1ml)和血尿素氮。 其它組家兔按甲兔出現(xiàn)痙攣抽搐的時(shí)間進(jìn)行用上述方法取血，測(cè)定GPT活力、血氨和BUN。 注：各組家兔都做谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血氨的測(cè)定；由于測(cè)定血漿BUN條件要求較高，甲、乙、丙兔可各選一組家兔進(jìn)行血漿BUN測(cè)定（方法參照試劑盒進(jìn)行)。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 游離肝臟和剪破鐮狀韌帶的動(dòng)作準(zhǔn)確、輕柔，以免肝葉破裂出血和損傷膈肌造成氣胸；結(jié)扎肝臟時(shí)，粗棉線要置于肝葉根部避免勒破肝臟，要用力結(jié)扎，阻斷肝臟的血液供應(yīng)。 2. 心臟取血方法可參照附錄或第三章相關(guān)內(nèi)容。注射器要肝素化并干燥，以免溶血；入針部位要準(zhǔn)確，垂直進(jìn)針，深度適當(dāng)；動(dòng)作要輕柔、迅速，盡可能縮短針頭在心臟停留的時(shí)間，防止凝血；針頭進(jìn)入胸壁后不能左右擺動(dòng)，以免損傷心、肺。 3. 血氨的測(cè)定可按照試劑盒提供的方法進(jìn)行或參照附錄的血濾液直接測(cè)定法進(jìn)行。 4．尿素氮的測(cè)定要按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。 【討論思考題】 1. 結(jié)扎肝門血管以及灌入氯化銨是否復(fù)制肝性腦病的動(dòng)物模型？為什么？ 2. 為什么要設(shè)立甲、乙、丙兔，作用何在？ 3. 灌入復(fù)方氯化銨溶液后，甲兔的呼吸如何變化？為什么？ 4. 哪些指標(biāo)說明肝功能損傷? 它們之間有何關(guān)系？道理何在？ 5. 氯化銨在哪些方面對(duì)CNS起作用？ 6. 根據(jù)氨中毒學(xué)說和上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推理，現(xiàn)設(shè)計(jì)一組小鼠實(shí)驗(yàn)方案，給藥劑量和分組見表6-13。 表中5只小鼠腹腔注入不同試劑后會(huì)出現(xiàn)什么表現(xiàn)？小鼠可能發(fā)生死亡的次序是什么？本實(shí)驗(yàn)說明什么問題？ 表 6-13 小鼠氨中毒的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 鼠號(hào) | 十二指腸或腹腔注射試劑 | 劑量 | 死亡次序 | 1 | 0.85%NaCl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 2 | 2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 3 | 0.5%醋酸，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 4 | 2.5%NH4Cl, 1.5%NaHCO3溶液 | 0.4ml/10g體重 | | 5 | 50%谷氨酸鈉，2.5%NH4Cl溶液 | 0.4ml/10g體重 | |
【附錄】 1．心臟取血：家兔的心臟在胸骨后正中央，約在第三至第五肋間。取血時(shí)，將家兔仰臥，在第三肋間胸骨左緣（兩前肢下緣連線與胸骨左緣交界)3mm處，或以左手拇指在胸骨一側(cè)，食指及中指于胸骨另側(cè)固定心臟，在心尖搏動(dòng)最明顯處將采血針與胸壁垂直刺入胸腔內(nèi)約2.5~3cm，當(dāng)持針手感到心臟搏動(dòng)時(shí)，再稍刺入即入心腔。然后抽出血液。取血時(shí)，針頭宜直入直出，勿在胸腔內(nèi)左右探索。 2．谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT)活性測(cè)定（賴氏法) GPT催化L-丙氨酸和a-酮戊二酸的反應(yīng)，生成丙酮酸和L-谷氨酸。一般以在一定的時(shí)間內(nèi)生成的丙酮酸多少確定GPT活力。丙酮酸能與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成黃色的丙酮酸-2,4二硝基苯肼，在堿性溶液中呈棕紅色。顏色的深淺與丙酮酸的量成正比�？赏ㄟ^同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液比較，算出GPT的活力。具體方法如下： ⑴ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備)：取試管6支，按表6-14操作 表 6-14 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的步驟 加入物（ml) | 空白管 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 0.10 | 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2mmol/L) | 0 | 0.05 | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | 0.50 | 0.45 | 0.40 | 0.35 | 0.30 | 0.25 | 37°C水浴預(yù)溫5min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 0.50 | 37°C水浴預(yù)溫20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 丙酮酸實(shí)際含量(mmol) | 0 | 0.10 | 0.20 | 0.30 | 0.40 | 0.50 | 相當(dāng)于GPT活力單位 | 0 | 28 | 57 | 97 | 150 | 200 |
加入0.4mol/L NaOH溶液后混勻，10分鐘后在520nm波長下比色，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度。以吸光度與活力單位繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ⑵ 血清GPT活力測(cè)定：取試管2支，按表6-15操作。 表 6-15 血清GPT活力測(cè)定步驟 加入物（ml) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | 0.50 | - | 37°C水浴預(yù)溫5min | 血清 | 0.10 | 0.10 | 搖勻，37°C水浴，準(zhǔn)確保溫30min | 2,4-二硝基苯肼溶液 | 0.50 | 0.50 | 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物溶液 | - | 0.50 | 搖勻，37°C水浴，保溫20min | 0.4mol/L NaOH溶液 | 5.0 | 5.0 |
混勻,靜置10min后，用蒸餾水調(diào)零,在520nm波長比色.測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出酶活力單位。 3. 氨定量測(cè)定--血濾液直接測(cè)定血氨方法 取試管3支，分別標(biāo)為測(cè)定管（u)、標(biāo)準(zhǔn)管（s)和空白管（b)，嚴(yán)格按下表的順序先加入10%鎢酸鈉1ml，再分別加入全血1ml、硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液1ml、無氨水1ml，用小玻棒混勻，再加入0.5mol/L硫酸1ml，混勻。見表6-16。 表 6-16 氨定量測(cè)定步驟 | 測(cè)定（u)ml | 標(biāo)準(zhǔn)（s)ml | 空白（b)ml | 10%鎢酸鈉 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 全血 | 1.0 | / | / | 硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液 | / | 1.0 | / | 無氨水 | / | / | 1.0 | 0.5mol/L硫酸 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
混勻后，離心沉淀（1500~2000轉(zhuǎn)′10分鐘)。 另取試管3支按表6-17操作。 表 6-17 血氨測(cè)定顯色步驟 | 測(cè)定（u)ml | 標(biāo)準(zhǔn)（s)ml | 空白（b)ml | 上清液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 顯色Ⅰ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 顯色Ⅱ液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
混勻后，置37°C水浴中20分鐘。然后用722分光光度計(jì)以620nm波長比色，空白調(diào)零。血氨計(jì)算：Du/Ds=血氨氮（mg/L)。 （注：我們用該法測(cè)定46只健康家兔空腹血氨水平為1.23±0.47mg/L)。 4．應(yīng)用試劑盒測(cè)定血氨按試劑盒提供的方法進(jìn)行。 5．血尿素氮測(cè)定按試劑盒上的方法進(jìn)行。 6．實(shí)驗(yàn)結(jié)果可參考表6-18記錄： 表 6-18 各組家兔癥狀及GPT、血氨、尿素氮的變化 組別 | 癥狀 | 劑量 | GPT（IU) | 血氨(mg/L) | 血BUN(mg/L) | | 呼吸深快 | 肌無力 | 抽搐 | （ml/kg) | 實(shí)驗(yàn)前 | 實(shí)驗(yàn)后 | 實(shí)驗(yàn)前 | 實(shí)驗(yàn)后 | 實(shí)驗(yàn)前 | 實(shí)驗(yàn)后 | 甲 | | | | | | | 1．23 ±0.47 | | 280±98 | | 乙 | | | | | | | | | 丙 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
注: 家兔實(shí)驗(yàn)前血BUN數(shù)據(jù)引自南京醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室。 | 
