天然藥物化學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

一、目的要求

1．掌握薄層板的制備及薄層層析的操作方法

2．掌握吸附劑活度測(cè)定的原理及方法

3．應(yīng)用薄層層析法檢測(cè)識(shí)中草藥化學(xué)成分

二、薄層板的制備

1．不加粘合劑的薄層涂布法

（1)氧化鋁薄層

將吸附劑置于薄層涂布器中，調(diào)節(jié)涂布器的高度，向前推動(dòng)，即得均勻薄層。本實(shí)驗(yàn)主要用下述簡(jiǎn)易操作涂布薄層，取表面光滑，直徑統(tǒng)一的玻璃一支，依據(jù)所制備薄層的寬度、厚度要求，在玻璃棒兩端套上厚度為0.3~1mm的塑料圈或金屬環(huán)，并在玻璃棒一端一定距離處套上較厚的塑料圈或金屬環(huán)，以使玻璃棒向前推動(dòng)時(shí)能保持平行方向，操作時(shí)，將氧化鋁粉均均地鋪在玻璃板上，勻速向前推動(dòng)。

（2)纖維素薄層

一般取纖維素粉1份加水約5份，在燒杯中混合均勻后，倒在玻璃板上，輕輕振動(dòng)，使涂布均勻，水平放置，待水分蒸發(fā)至近干，于100±2℃干燥30~60分鐘即得。

（3)聚酰胺薄層

取錦綸絲（無(wú)色干凈廢絲即可)用乙醇加熱浸泡2~3次，除去臘質(zhì)等。稱取洗凈的錦綸絲1克，加85%甲酸ml，在水浴上加熱使溶，再加70%乙醇6ml。繼續(xù)加熱使完全溶解成透明膠狀溶液。將此溶液適量倒在水平放置的，用清潔液洗凈的玻璃片上，并自然向周?chē)�推勻，厚度約0.3mm，薄層太厚時(shí)，干后會(huì)裂開(kāi)。將鋪好的薄層水平放在盛溫水的盤(pán)上，使盤(pán)中的水蒸汽能熏濕薄層，盤(pán)子加玻璃板蓋嚴(yán)密，薄板放置約1小時(shí)完全固化變不透明白色，再放數(shù)小時(shí)后，泡在流水中洗去甲酸，先在空氣中晾干，后在烘箱中0℃恒溫加熱活化15分鐘，冷后置干燥器中貯存?zhèn)溆谩?/P>

2．加粘合劑薄層的涂布法

（1)硅膠G薄層  

取硅膠G或硅膠GF一份，置燒杯中加水約5份混合均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推動(dòng)涂布)，均勻涂布成0.25~0.5mm厚度，輕輕振動(dòng)玻璃板，使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小時(shí)，冷后貯于干燥器內(nèi)備用�；罨瘻囟群蜁r(shí)間可依需要調(diào)整，一般檢識(shí) 

水溶性成分或一些極性大的成分時(shí)，所用薄層板只在空氣中自然干燥，不經(jīng)活化即可貯存?zhèn)溆谩?/P>

（2)硅膠（H)羧甲基纖維鈉（CMC-Na)薄層  

取羧甲基纖維素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加熱攪拌使完全溶解，倒入燒杯中，加薄層層析用硅膠（顆粒度10~40μm的約6~8g)。激光照排系統(tǒng)混成均勻的稀糊，按照硅膠G薄層涂布法制備薄層，或取0.8%羧甲基纖維納10ml，倒入廣口瓶（高約10~12cm)中，然后逐步加入薄層層析用硅膠3.3克，不斷振搖成均勻的稀糊，把兩塊載玻片面對(duì)面結(jié)合在一起，這樣每片只有一面與硅膠糊接觸，使薄片浸入硅膠稀糊中，然后慢慢取出，分開(kāi)二塊薄片，將未粘附硅膠糊的那一面水平放在一張清潔的紙上，讓其自然陰干，100℃下烘30分鐘。冷后于干燥器內(nèi)備用。未消耗的硅膠稀糊可貯存在廣口瓶?jī)?nèi)，以供再用。

氧化鋁薄層，氧化鋁羧甲基纖維鈉薄層的制備方法同上，一般所需要氧化鋁比硅膠稍多。

目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)有預(yù)先制好的薄層板，底板用玻璃、塑料、鋁片等�？砂葱枰�用玻璃刀劃割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，價(jià)格貴些。

3．特殊薄層的制備

根據(jù)分離工作的特殊需要，可制成以下幾種特制薄層。

（1)酸、堿薄層和pH緩沖薄層

為了改變吸附劑的酸堿性，以改進(jìn)分離效果，可在吸附劑中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液)代替水制成酸性氧化鉛薄層使用，硅膠微呈酸性，可在鋪層時(shí)用稀堿溶液（如0.1~0.5N氫氧化鈉溶液)代替水制成堿性的硅膠薄層。當(dāng)用醋酸鈉、磷酸鹽等不同pH的緩沖液代替水鋪層，制成一定pH緩沖的薄層。

羧甲基纖維素鈉的溶液一般用0.5~1%濃度，宜預(yù)先配制后靜置，取其上層澄清溶液應(yīng)用，則所制備的薄層表面較為細(xì)膩平滑。常用0.8%濃度。CMC-Na系中粘度。300~500厘泊（粘度單位)。CMC-Na系碳水化合物，調(diào)制時(shí)應(yīng)在水浴上進(jìn)行�；罨瘻囟炔粦�(yīng)過(guò)高，防止碳化。

（2)絡(luò)合薄層

硝酸銀薄層的制法，可在吸附劑中加入5~25%硝酸銀水溶液代替水制成均勻糊狀，再按常法鋪成薄層，制成薄層避光陰干，于105℃活化半小時(shí)后避光貯存，制成的薄層以不變成灰色為好，在三天內(nèi)應(yīng)用。也可先把硝酸銀用少量水溶解，再用甲醇稀釋成10%溶液，把預(yù)先制好的硅膠G薄層浸入此溶液中約1分鐘，取出避光陰干，按上法活化，貯存。

三、吸附劑的活度測(cè)定

1．氧化鋁活度的測(cè)定

一般可用4~5種偶氮染料以薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。 

染料試劑的配制：取偶氮苯（Azobenzene)50mg，對(duì)甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene),蘇丹黃（Sudan I, Benzeneazo-β-naphthol)，蘇丹紅（Sudan Ⅲ Tetrazobenzol-β-naphthol)，對(duì)氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene)各20mg，分別溶于50ml重蒸餾的四氯化碳（經(jīng)氫氧化鈉干燥)中。

常法制備不含粘合劑氧化鋁薄層，以鉛筆尖或毛細(xì)管尖在薄層板一端2~3 cm處間隔1cm左右輕輕點(diǎn)上5個(gè)可以看清的小點(diǎn)，各吸取約0.02ml染料試劑分別點(diǎn)滴于原點(diǎn)上，以四氯化碳為展開(kāi)劑，展開(kāi)時(shí)薄層板與容器底部交角為10~40°之間，展開(kāi)后測(cè)出各斑點(diǎn)的Rf值，從表1確定氧化鋁的活度（一般高活性氧化鋁Ⅰ~Ⅲ級(jí)活度使用本法時(shí)，結(jié)果往往偏低)。

另取不含粘合劑氧化鋁薄層板一塊，置于水蒸汽飽和容器內(nèi)，2~3小時(shí)后取出，按上述方法測(cè)定活度。觀察有無(wú)變化。 

表1  氧化鋁活度與偶氮染料外值關(guān)系

2．硅膠活度的測(cè)定

一般選用三種染料的薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。

歐洲藥典1969年記載用0.01%二甲基黃（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene)。蘇丹紅（Sudan Ⅲ)，靛酚藍(lán)（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline)的苯溶液各10μl點(diǎn)滴于硅膠G或硅膠H薄層上，以苯為展開(kāi)劑，展開(kāi)10cm（約20分鐘)，三種染料應(yīng)明顯分離，靛酚藍(lán)斑點(diǎn)接近于起始線。二甲基黃斑點(diǎn)在薄層的當(dāng)中。蘇丹紅斑點(diǎn)與二甲基黃斑點(diǎn)之間，則認(rèn)為薄層板活性符合要求。

國(guó)內(nèi)青島海洋化工廠出售薄層層析用的硅膠在吸附劑名稱之后加幾個(gè)字標(biāo)明的意思是：硅膠G（G是Gypsum石膏的縮寫(xiě)。表示加了石膏)，硅膠H（H表示不加石膏)，硅膠GF254（F254表示加石膏和波長(zhǎng)254顯綠色熒光的硅酸鋅錳)。硅膠GF365（表示加石膏和波長(zhǎng)365nm顯黃色熒光的硫化鋅鎘)。氧化鋁則類(lèi)推。

四、薄層層析的應(yīng)用

薄層層析法在天然藥物化學(xué)成分的研究中，主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒 

定及探索柱層分離的條件。用薄層層析進(jìn)行中草藥化學(xué)成分檢識(shí)，可依據(jù)各類(lèi)成分性質(zhì)及熟知的條件有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展開(kāi)后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠，不僅可通過(guò)顯色獲知成分類(lèi)型，而且可初步了解主要成分的數(shù)目及其極性大小。

例一  湖北貝母生物堿成分的TLC檢識(shí)

吸附劑：硅膠CMC- Na薄層

樣品：湖北貝母總生物堿氯仿溶液

展開(kāi)劑：C₆H₅-EtoAc-NHEt₂（6：4：1)

顯色劑：改良碘化鉍鉀噴霧

例二   丹參色素的TLC檢識(shí)

吸附劑：硅膠G-CMc-Na板

樣品：丹參乙醚提取液

展開(kāi)劑：石油醚-醋酸乙酯（9：1)

記錄TLC結(jié)果

五、思考題

1. 為何在鋪板之前，色譜用的玻璃板要完全洗凈并干燥？

2. 為何鋪好的TLC板用前要在烘箱中干燥？

六、參考文獻(xiàn)

1．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所：薄層層析及其在中草藥分析中的應(yīng)用，1978。

2．E．菜德雷，M·菜德雷合著：陶義訓(xùn)、馬立人、夏壽宣合譯：色譜法。

3．全國(guó)高等醫(yī)藥院校試用教材：中草藥化學(xué)，1980。

4．Stahl E，td，Thin Layer Chromatography 2nd edu，1969。

5．E．  Heffmann：Chromatography 3nd edu 1975。

  黃連為毛莨科黃連屬植物黃連、三角葉黃連或云連等的干燥根莖。具有清熱燥濕、清心除煩、瀉火解毒的功效。黃連的有效成分主要是生物堿，已分離出的主要有：小檗堿（Berbenie)，又名黃連素，巴馬丁、黃連堿，甲基黃連堿、藥根堿、表木蘭堿等，其中以m.gydjdsj.org.cn/pharm/小檗堿含量最高，可達(dá)10%左右，且以鹽酸鹽的狀態(tài)存在于黃連中。小檗堿鹽酸對(duì)痢疾桿菌、葡萄球菌和鏈球菌等均有顯著抑制作用，臨床用于治療細(xì)菌性痢疾和胃腸炎等，無(wú)耐藥性和副作用。

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/B>

1、  掌握鹽酸小檗堿的一種提取方法，熟悉鹽析法、重結(jié)晶法。

2、  掌握小檗堿的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，特殊的理化性質(zhì)和薄層鑒定方法。

3、  通過(guò)實(shí)驗(yàn)熟悉和掌握柱層析法的分離原理及操作技能。

二、 小檗堿的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

小檗堿為黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶，具5.5個(gè)結(jié)晶水，m.p145℃，能緩緩溶于冷水中（1：20)，微溶于冷乙醇（1：100)，易溶于熱水和熱乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，與酸結(jié)合成鹽時(shí)失去一分子水，其硝酸鹽和氫碘酸鹽極難溶于水，鹽酸鹽微溶于冷水，較易溶于沸水，其硫酸鹽，構(gòu)椽酸鹽在水中溶解度較大。鹽酸小檗堿為黃色結(jié)晶，含2分子結(jié)晶水，220℃左右分解為棕紅色小檗紅堿，285℃左右完全溶融，UVλmax265nm，343nm。游離小檗堿易和1分子丙酮或1分子氯仿或1.5分子苯結(jié)合成一黃色絡(luò)合物晶體。

三、 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)利用小檗堿與含氧酸（硝酸例外)所成鹽在水中溶解度較大的性質(zhì)，采用稀硫酸將其以硫酸鹽形式提取出來(lái)，再根據(jù)小檗堿與氫鹵酸所成鹽在水中溶解度較小的特點(diǎn)，在將小檗堿游離后，加入鹽酸使其形成鹽酸鹽，結(jié)合成鹽析法，使之沉淀析出。

四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、提取

取黃連粗粉25克，加入0.2%H₂SO₄液200ml加熱煎煮1小時(shí)（注意隨時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)損失的溶劑)，紗布過(guò)濾，殘?jiān)�再�?.2%H₂SO₄液200ml 加熱煎煮45分鐘，紗布過(guò)濾，兩次濾液合并。向?yàn)V液中加入石灰乳調(diào)節(jié)pH12，抽濾，再向抽濾所得的濾液中滴加濃HCl，調(diào)節(jié)pH2-3，然后加入8%（W/V)氯化鈉，攪拌并使完全溶解，并繼續(xù)攪拌至溶液出現(xiàn)微濁現(xiàn)象為止，放置過(guò)夜。則有鹽酸小檗堿沉淀析出。

2、分離及精制

   抽濾，得鹽酸小檗堿粗品，水洗，加適量蒸餾水加熱溶解，趁熱抽濾，濾液放置，則有鹽酸小檗堿結(jié)晶析出。再進(jìn)行重結(jié)晶：即濾取結(jié)晶，加入適量乙醇，水浴加熱溶解，趁熱抽濾，濾液放置結(jié)晶。待鹽酸小檗堿析出完全后，濾出，80℃干燥，得成品。

3、鹽酸小檗堿的檢識(shí)

（1)取鹽酸小檗堿少許，加10%稀硫酸適量使之溶解后，加入一點(diǎn)漂白粉，即顯櫻紅色。

（2)取鹽酸小檗堿少許，加熱使期溶于水中，加10%NAOH使呈強(qiáng)堿性，然后滴加丙酮數(shù)滴，可見(jiàn)有黃色結(jié)晶性的小檗堿丙酮加成物生成。

4、薄層層析鑒定

薄層板：硅膠G-CMC板

樣品：實(shí)驗(yàn)所得精制鹽酸小檗堿的醇溶液

對(duì)照品：1%鹽酸小檗堿的醇溶液

展開(kāi)劑：氯仿：甲醇=7：2，氨水飽和20分鐘

展距：10cm

顯色：自然光下觀察

結(jié)果：計(jì)算Rf值

5、柱層析分離

吸附劑：12克氧化鋁（80-100目)

層析柱：1х40cm玻璃柱（也可用堿式滴定管代替)

洗脫劑：95%乙醇

（1)氧化鋁吸附柱的制備（濕法裝柱)

取一根25cm堿式滴定管代作層析管用，管的下端套一段約3-4cm長(zhǎng)的乳膠管，在乳膠管上夾一螺旋夾，以控制洗脫液流出速度。在層析管的下端填一層松緊合適平整的脫脂棉。將此層析管垂直地固定在鐵架臺(tái)上，關(guān)閉螺旋夾。

管內(nèi)先加入一定體積的洗脫劑（此處用95%乙醇)，打開(kāi)螺旋夾，放出管內(nèi)乙醇，將層析管下端的脫脂棉內(nèi)的空氣充分趕盡，然后再向?qū)游龉苤屑尤胍欢�體積的乙醇。

取中性氧化鋁（100-200目)12克于燒杯中，加一定體積的乙醇調(diào)成漿狀，趕盡其中氣泡，然后通過(guò)小玻璃漏斗將漿狀氧化鋁徐徐注入注中，并同時(shí)打開(kāi)下端螺旋夾，讓洗脫劑緩緩流出，不斷用手輕輕振動(dòng)玻璃柱，使氧化鋁沉降均勻。當(dāng)柱內(nèi)液面接近氧化鋁柱面時(shí)，關(guān)閉螺旋夾。

（2) 樣品的加入

稱取50-100mg鹽酸小檗堿，加少量95%乙醇于水浴上加熱溶解，用滴管沿層析管壁小心加入，勿使氧化鋁柱面受到振動(dòng)。找開(kāi)螺旋夾，當(dāng)液體表面下降接觸氧化鋁時(shí)，關(guān)閉螺旋夾。

（3)洗脫

用滴管吸取95%乙醇，經(jīng)管壁輕輕加入柱內(nèi)，打開(kāi)螺旋夾，控制流速20-30滴/分鐘，不斷加入洗脫劑，使洗脫劑的液面始終高于氧化鋁。待氧化鋁柱上呈現(xiàn)數(shù)段不同顏色的色帶時(shí)，繼續(xù)沖洗，使其彼此分離，并收集鮮黃色帶，此段為鹽酸小檗堿，其余色帶為其它成分。

五、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

1、整個(gè)操作過(guò)程，氧化鋁柱表面應(yīng)保持一定高度的溶劑（洗脫劑)，不得使柱面溶劑流干。

2、一般采用等量收集洗脫液流份。每份洗脫劑體積的毫升數(shù)，一般與吸附劑重量相近。如果洗脫劑極性較大或樣品各組份結(jié)構(gòu)相近似時(shí)，每份收集量要��；

3、洗脫時(shí)流速不宜過(guò)快，太快時(shí)柱中交換來(lái)不及達(dá)到平衡，影響分離效果；

4、由于氧化鋁表面活性較大，有時(shí)會(huì)促使某些成分發(fā)生變化，應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱層析的分離，以免樣品在柱上起異構(gòu)化、氧化、皂化、水合以及脫氫形成雙鍵等反應(yīng)。樣品在柱上會(huì)擴(kuò)散也會(huì)影響分離效果。

5、氧化鋁的粒度一般為100-200目，用量一般為樣品量的20-50倍，根據(jù)被分離的化合物而定，有時(shí)可達(dá)100-200倍。硅膠吸附柱層析粒度一般為100-160目或160目以上，用量為樣品量的30-60倍，較難分離的化合物可選用500-1000倍。

六、思考題

1、采用柱層析分離時(shí)應(yīng)注意哪些方面的問(wèn)題？

2、為什么本實(shí)驗(yàn)采用氧化鋁而不采用硅膠作吸附劑？

  蘆丁（Rutin)廣泛存在于植物界中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物至少在70種以上，如煙葉、槐花、蕎麥和蒲公英中均含有。尤以槐花米（為植物Sophora japonica的未開(kāi)放的花蕾)和蕎麥中含量最高，可作為大量提取蘆丁的原料。

槐花米為豆科植物槐花的未開(kāi)放花蕾。味苦性涼，具清熱、涼血、止血之功�；被ǖ闹饕�化學(xué)成分為蘆丁，又名蕓香甙，含量可達(dá)12-16%。

蘆丁是由槲皮素（Quercetin)3位上的羥基與蕓香糖（Rutinose)〔為葡萄糖（Glucose)與鼠李糖（Rhamnose)組成的雙糖〕脫水合成的苷。為淺黃色粉末或極細(xì)的針狀結(jié)晶，含有三分子的結(jié)晶水，熔點(diǎn)為174~178℃，無(wú)水物188~190℃。溶解度：冷水中為1:10000；熱水中1:200；冷乙醇1:650；熱乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于堿而呈黃色。

蘆丁具有維生素P樣作用�？山档兔�細(xì)管前壁的脆性和調(diào)節(jié)滲透性，有助于保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，臨床上用作毛細(xì)管脆性引起的出血癥，并常用作防治高血壓病的輔助治療劑。現(xiàn)在國(guó)處也常用蘆丁作食品及飲料的染色劑。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/B>

1．通過(guò)蘆丁的提取與精制掌握堿-酸法提取黃酮類(lèi)化合物的原理及操作。

2．掌握蘆丁的一種提取、精制方法及提制過(guò)程中防止甙水解的方法。

3. 掌握黃酮甙水解生成甙元的方法及二者之間的分離。

4．熟悉蘆丁、槲皮素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、檢識(shí)方法和紙層析鑒定方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)主要是利用蕓香苷中含有較多的酚羥基，可溶于堿中，加酸酸化后又可析出蕓香苷結(jié)晶的性質(zhì)，采用堿溶酸沉法提取，并用蕓香苷對(duì)冷、熱水的溶解度相差懸殊的特性進(jìn)行精制。蘆丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通過(guò)紙層析鑒定。蘆丁及槲皮素還可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)及紫外光譜鑒定。

三、實(shí)驗(yàn)材料

槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、濃鹽酸、正丁醇、醋酸、氨水、1％的氫氧化鈉溶液、1％的三氯化鋁乙醇溶液、1％的葡萄糖溶液、1％的鼠李糖溶液、1％蕓香苷乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、碳酸鋇、廣泛pH試紙、中速層析濾紙等。

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一)提取：

稱取槐米30g，在乳缽中研碎后，投入300ml0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分鐘，在攪拌下加入石灰乳調(diào)pH9，煮沸40分鐘（注意添加水，保持原有體積，保持pH8~9)，趁熱傾出上清液,用棉花過(guò)濾。殘?jiān)��?00ml水，加石灰乳調(diào)pH9，煮沸30分鐘，趁熱用棉花過(guò)濾，二次濾液合并。濾液保持在60℃，加濃HCl，調(diào)pH2-3，放置過(guò)夜，則析出蘆丁沉淀。

加0.4％硼砂水溶液200ml，在攪拌下加石灰乳調(diào)pH值至8~9，加熱，煮沸15min，隨時(shí)補(bǔ)充失去的水分，保持pH8~9，傾出上清液，用四層紗布過(guò)濾；同樣操作再提取一次。合并兩次濾液，放冷，并用鹽酸調(diào)pH至2~3，放置過(guò)夜，待析出結(jié)晶，過(guò)濾，濾餅用蒸餾水洗至pH5-6，抽干，置空氣中晾干，得粗制蕓香苷，稱重，計(jì)算得率。

（二)精制：

將蕓香苷粗品懸浮于蒸餾水中，煮沸至蕓香苷全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分鐘，趁熱抽濾，冷卻后即可析出結(jié)晶，抽濾至干，置空氣中晾干，或60~70℃干燥，得精制蕓香苷，稱重，計(jì)算得率。

（三)蕓香苷的水解：

取蕓香苷1g，研碎，加2％硫酸水溶液80ml，小火加熱，微沸回流30-60min，并及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。在加熱過(guò)程中，開(kāi)始時(shí)溶液呈渾濁狀態(tài)，約10min后，溶液由渾濁轉(zhuǎn)為澄清，逐漸析出黃色小針狀結(jié)晶，即水解產(chǎn)物槲皮素，繼續(xù)加熱至結(jié)晶物不再增加時(shí)為止。抽濾，保留濾液20ml，以檢查濾液中的單糖。所濾得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70％乙醇80ml加熱回流使之溶解，趁熱抽濾，放置析晶。抽濾，得精制槲皮素。減壓下110℃干燥，可得槲皮素?zé)o水物。

(四)  蕓香苷、槲皮素及糖的檢識(shí)

1．顏色反應(yīng)

① α-萘酚-濃硫酸（Molisch)試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加乙醇1ml振搖，加α-萘酚試劑2~3滴振搖，傾斜試管，沿管壁徐徐加入0.5ml濃硫酸，靜置，觀察兩層溶液界面變化，出現(xiàn)紫紅色環(huán)者為陽(yáng)性反應(yīng)，表示試樣的分子中含有糖的結(jié)構(gòu)，糖和甙類(lèi)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，比較蕓香苷和槲皮素的不同。

②鹽酸-鎂粉試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加5％乙醇2ml，在水浴中加熱溶解，滴加濃鹽酸2滴，再加鎂粉約50mg，即產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)。溶液逐漸由黃色變?yōu)榧t色。

③ 三氯化鐵試驗(yàn)

取樣品水或乙醇液，加入三氯化鐵試劑數(shù)滴，觀察顏色變化。

④三氯化鋁試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加熱溶解，加1％三氯化鋁甲醇試劑2~3滴，呈鮮黃色。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素。

⑤醋酸鎂試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加熱溶解，加1％醋酸鎂甲醇試劑2~3滴，呈黃色熒光反應(yīng)。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素（反應(yīng)也可在濾紙上進(jìn)行，觀察熒光)。

⑥ 氧氯化鋯-枸櫞酸試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加甲醇1~2ml，在水浴上加熱溶解，再加2％氧氯化鋯甲醇試劑3~4滴，呈鮮黃色。然后加2%枸櫞酸甲醇試劑3~4滴，黃色變淺，加蒸餾水稀釋變無(wú)色。以同樣方法試驗(yàn)槲皮素進(jìn)行對(duì)照。

⑦ 氫氧化鈉試驗(yàn)：

取蕓香苷少許置于試管中，加水2ml振搖，觀察試管中有無(wú)變化。滴加1％氫氧化鈉溶液數(shù)滴，振搖使溶解，呈黃色澄清溶液。再加入1％鹽酸溶液數(shù)滴使呈酸性反應(yīng)，則溶液由澄清轉(zhuǎn)為渾濁狀態(tài)。

2．色譜檢識(shí)

(1)  槲皮素和蘆丁的薄層鑒定

①聚酰胺薄層色譜：

 固定相：聚酰胺薄層板

樣品：a精制蘆丁  b蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品  c精制槲皮素

展開(kāi)劑：氯仿—甲醇—丁酮—乙酰丙酮：(16：10：5：1)

顯色：

a可見(jiàn)光下觀察色斑，再于紫外燈下觀察熒光斑點(diǎn)

b噴灑AlCl₃乙醇液后觀察。

②硅膠薄層色譜

吸附劑：硅膠G，105℃下活化2h

展開(kāi)劑：a.氯仿：甲醇：甲酸（15：5：1)

b.氯仿：丁酮：甲酸（5：3：1)

顯色劑：1%FeCl₃和1%K₃[Fe（CN)₆]水溶液，應(yīng)用時(shí)等體積混合。

(2) 蕓香苷和槲皮素的紙色譜檢識(shí)：

支持劑：新華層析濾紙（中速、20cmХ7cm)

樣  品：自制1％蕓香苷乙醇溶液

   自制1％槲皮素乙醇溶液

對(duì)照品：1％槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品與1％蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液

展開(kāi)劑：a. 正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上層)

   b. 15％醋酸水溶液

展距：10-15cm

顯色：a. 在可見(jiàn)光下觀察斑點(diǎn)顏色，再在紫外燈下觀察斑點(diǎn)顏色

 b. 噴三氯化鋁試劑呈黃色斑點(diǎn)

c．經(jīng)氨氣熏后再于可見(jiàn)、紫外下觀察。

(3) 糖的紙色譜檢識(shí)：取上述蕓香苷水解后的母液20ml，加入氫氧化鋇細(xì)粉（約2.6g)中和至pH7，濾除生成的硫酸鋇沉淀（可用滑石粉助濾)。濾液中水浴中濃縮至1~2ml，供紙色譜點(diǎn)樣用。

支持劑：新華層析濾紙（中速、20cmХ7cm)

樣  品：水解濃縮液

對(duì)照品：a. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品水溶液

b. 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品水溶液

展開(kāi)劑：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上層)

顯  色：a. 噴苯胺-鄰苯二甲酸試劑，于105℃加熱10min，顯棕色或棕紅色斑點(diǎn)

b.噴氨性硝酸銀試劑，于100℃左右加熱，呈棕褐色斑點(diǎn)。

五、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

1．本實(shí)驗(yàn)采用堿溶酸沉法從槐米中提取蕓香苷，收率穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便。在提取前應(yīng)注意將槐米略搗碎，使蕓香苷易于被熱水溶出�；被ㄖ泻�有大量粘液質(zhì)，加入石灰乳使生成鈣鹽沉淀除支。pH應(yīng)嚴(yán)格控制在8-9，不得超過(guò)10。因?yàn)樵趶?qiáng)堿條件下煮沸，時(shí)間稍長(zhǎng)可促使蕓香甙水解破壞，使提取率明顯下降。酸沉一步pH為2-3，不宜過(guò)低，否則會(huì)使蕓香甙形成鹽溶于水，降低了收率。

2．提取過(guò)程中加入硼砂水的作用：即能調(diào)節(jié)堿性水溶液的pH，又能保護(hù)蕓香甙分子中的鄰二酚羥基不被氧化，亦保護(hù)鄰二酚羥基不與鈣離子絡(luò)合，使蕓香甙不受損失。

3．蕓香甙的提取方法除了用堿溶酸沉法外，還可利用蕓香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。又報(bào)道將生產(chǎn)工藝改進(jìn)為95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后將粗浸膏經(jīng)除去脂溶性雜質(zhì)后，用水洗凈，過(guò)濾，干燥即得蕓香甙，可提高收率6．96%，并降低了成本。因此可根據(jù)不同原料采用各種不同方法提取。

4．槲皮素以乙醇重結(jié)晶時(shí)，如所用的乙醇濃度過(guò)高（90％以上)，一般不易析出結(jié)晶。此時(shí)可于乙醇溶液中滴加適量蒸餾水，使呈微濁狀態(tài)，放置，槲皮素即可析出。

六、思考題

1．本實(shí)驗(yàn)提取過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？

2．根據(jù)蕓香苷的性質(zhì)還可采用何種方法進(jìn)行提��？簡(jiǎn)要說(shuō)明理由。

七、參考文獻(xiàn)

www.med126.com1．海藥物研究所：中草藥有效成分的提取和分離  234—240頁(yè)

2．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所：中草藥有效成分的研究(第一分冊(cè))219—225 1972

3．日本藥學(xué)雜志，72(333) 1952；76(1210) 1956，80(304) 1960；80(698)  1960

4．Chem，  Pharm．  Bull，  ll  (167)，  1963