第12章 抗病毒治療新技術(shù)
病毒感染性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。在人類每年流行的傳染病中，由病毒引起的約占75%。病毒感染后可引起急性感染，亦可引起持續(xù)性感染，并與一些腫瘤、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及神經(jīng)性疾病的發(fā)生有一定的關(guān)系。目前，絕大部分病毒性疾病，特別是慢性病毒感染仍缺乏有效的治療措施。因此，探索新的抗病毒藥物和治療方法已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，以及對病毒生物學(xué)特性和致病機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，人們能夠在基因水平上尋找抗病毒治療的新途徑，逐漸建立了抗病毒基因治療技術(shù)，并在應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)新型抗病毒藥物等方面取得重要進(jìn)展。
基因治療（gene therapy)是指通過基因轉(zhuǎn)移或基因修飾方法，將具有表達(dá)功能的基因?qū)氲较嚓P(guān)細(xì)胞和組織中，使轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的一種治療方法。進(jìn)行基因治療時，應(yīng)根據(jù)宿主細(xì)胞病變基因表達(dá)水平的異常狀況，采取不同的策略，以提高或補(bǔ)足表達(dá)水平低下的基因，或降低表達(dá)水平過高的基因，或?qū)υ谡顩r下不表達(dá)的基因進(jìn)行封閉或破壞。
基因置換（gene replacement) 是把正常的外源基因?qū)肷矬w靶細(xì)胞內(nèi)，對產(chǎn)生疾病的基因進(jìn)行置換。理想的基因治療方式是，將缺陷基因原位校正，并保證患者基因組序列不發(fā)生其他改變，能接受體內(nèi)原有的復(fù)雜調(diào)控，維持原有的時空表達(dá)模式。
基因修正（gene correction) 是將致病基因中發(fā)生突變的堿基部分予以更換或原位修復(fù)致病基因的功能，并不一定改變致病基因的核苷酸順序。這種治療方法頗具吸引力，但是，原位修正基因的策略目前在技術(shù)上尚存在許多困難。
基因修飾（gene augmentation) 是將有功能的目的基因?qū)氲桨l(fā)生病變或正常細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能補(bǔ)償致病基因的功能，但致病基因本身并未得到改變。與基因置換和基因修正策略相比，基因修飾容易實(shí)現(xiàn)，因此，該策略目前在基因治療中得到廣泛應(yīng)用。
基因失活（gene inactivation) 是應(yīng)用各種手段封閉或阻斷致�。ㄓ泻�)基因的表達(dá)。對于病毒感染性疾病來說，基因失活是一種具有很好應(yīng)用前景的基因治療策略。因?yàn)閺幕蛩缴蠈⒉《镜幕蚪M封閉或破壞后，就不能有效地表達(dá)病毒抗原，從而不會產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)。
基因疫苗（gene vaccine) 是用表達(dá)載體導(dǎo)入病原體抗原基因，表達(dá)的目的蛋白可誘導(dǎo)保護(hù)性粘膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，或打破對某種病原體感染所引起的免疫耐受，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。
基因治療必須具備以下3個條件：
目的基因的獲得 主要方法有：cDNA的克隆，基因的人工合成，基因的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增及染色體基因組DNA的降解與克隆等方法。目前基因治療中應(yīng)用的目的基因多數(shù)是cDNA。
靶細(xì)胞的選擇 基因治療的靶細(xì)胞有二大類：生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。目前體細(xì)胞比生殖細(xì)胞的基因治療發(fā)展得更為成熟。靶細(xì)胞的選擇條件為：根據(jù)基因異常表現(xiàn)的器官及其部位；易取出和移植；易在體外進(jìn)行培養(yǎng)；體外易被轉(zhuǎn)導(dǎo)；具有較長的壽命。
基因轉(zhuǎn)移的方法 將外源性基因?qū)氚屑?xì)胞的技術(shù)可分為物理、化學(xué)和生物學(xué)方法三大類。物理化學(xué)方法有磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體法、微注射法、顆粒轟擊（基因槍)以及電穿孔法等，其優(yōu)點(diǎn)是簡單易行，缺點(diǎn)是攜帶的遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)易受DNA酶降解，且不易穩(wěn)定地存在于細(xì)胞基因組中。生物學(xué)方法主要指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV)、腺病毒（AdV)、腺病毒相關(guān)病毒（AAV)、單純皰疹病毒（HSV)、痘苗病毒（VV)等，特點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移效率較高，已成為基因治療應(yīng)用最廣、最有效的基因轉(zhuǎn)移方法。
基因治療方式主要有兩類：一類是直接體內(nèi)轉(zhuǎn)移（in vivo)，亦稱活體直接轉(zhuǎn)移，是將帶有遺傳物質(zhì)的病毒、脂質(zhì)體或裸露DNA直接注射到試驗(yàn)個體內(nèi)；另一類是間接體內(nèi)轉(zhuǎn)移（ex vivo)，亦稱回體轉(zhuǎn)移，是在體外將目的基因?qū)氲揭欢ǖ募?xì)胞中，使其表達(dá)和分泌特定的重組蛋白，然后將這些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞輸回試驗(yàn)個體內(nèi)。
exvivo方法較常用，效果較易控制，但步驟多，技術(shù)復(fù)雜難度大，不易推廣；in vivo方法尚未成熟，存在轉(zhuǎn)移效率低、療效短等問題，但操作簡便，容易推廣，是基因轉(zhuǎn)移研究的方向。只有invivo基因轉(zhuǎn)移方法成熟了，基因治療才能真正走向臨床。
病毒感染性疾病是病毒與宿主細(xì)胞相互作用執(zhí)業(yè)醫(yī)師的結(jié)果，因此，抗病毒治療應(yīng)采取既針對病毒，又針對宿主的綜合措施。在應(yīng)用抗病毒制劑抑制或終止病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的同時，還需通過提高宿主的免疫應(yīng)答，清除體內(nèi)游離病毒和受病毒感染細(xì)胞，從而達(dá)到治愈病毒感染的目的。在眾多有潛在應(yīng)用價值的新型抗病毒治療策略中，抗病毒基因治療技術(shù)尤為令人矚目，它是基因治療理論和方法在控制病毒性疾病領(lǐng)域的一個重要應(yīng)用，同時，抗病毒感染基因治療的研究和應(yīng)用又豐富和發(fā)展了基因治療的理論和技術(shù)。
在抗病毒感染基因治療領(lǐng)域，基因修飾和基因失活是目前應(yīng)用的主要策略。針對提高人體對病毒的免疫力，采用基因修飾技術(shù)，將抗病毒的基因?qū)胨拗鞯玫奖磉_(dá)；針對降低或消除病毒的致病力，從分子水平上抑制或封閉病毒基因的復(fù)制和表達(dá)。因此，抗病毒基因治療策略可以概括為3個方面。
增強(qiáng)宿主免疫力 利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將目的基因?qū)塍w內(nèi)使其表達(dá)，表達(dá)的病毒抗原刺激宿主產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。宿主免疫力具有抵抗病毒感染并從病毒感染中恢復(fù)的重要功能。設(shè)法將受病毒感染細(xì)胞在病毒基因復(fù)制和表達(dá)之前將其破壞，使病毒不能包裝成完整的病毒顆粒，這是設(shè)計(jì)細(xì)胞自殺基因治療的思路。同時要求將所有受病毒感染的細(xì)胞殺死，但對正常細(xì)胞沒有影響。設(shè)計(jì)細(xì)胞自殺機(jī)制主要有三個途徑：病毒主導(dǎo)性酶藥物預(yù)施療法（VDEPT)、白喉毒素基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡。
促進(jìn)抗病毒蛋白的產(chǎn)生 將抗病毒蛋白基因?qū)氩∪四┥已馨图?xì)胞或造血干細(xì)胞后，再將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，通過細(xì)胞表達(dá)和分泌的抗病毒蛋白進(jìn)行抗病毒治療。例如，將可溶性CD4蛋白和IgG蛋白的融合基因或干擾素、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子基因?qū)爰?xì)胞中表達(dá)。
細(xì)胞內(nèi)免疫 在感染或非感染細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某種基因，通過表達(dá)的目的蛋白抑制病毒復(fù)制和表達(dá)，達(dá)到抗病毒治療和預(yù)防的目的，即對其中已感染的病毒具有抑制或阻斷作用，或?qū)Σ《靖腥镜墓艟哂械挚沽Αａ槍@類轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞來說，好像是對病毒的感染具有一定的免疫力。但這種形式的抗病毒免疫是由于細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)而產(chǎn)生的，故稱之為細(xì)胞內(nèi)免疫（intracellularimmunization)，主要有RNA誘餌（RNA decoy)、反義RNA、核酶（ribozyme)、病毒顯性突變蛋白和細(xì)胞內(nèi)抗體（intracellularantibodies)等方法，已成為抗病毒感染基因治療的主要策略。
以堿基配對方式結(jié)合、抑制、封閉或破壞基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)活性的核酸分子，稱為反義核酸分子（或稱“基因封條”)，包括反義DNA和反義RNA。研究反義DNA或反義RNA的來源、性質(zhì)及其作用機(jī)制的技術(shù)稱為反義技術(shù)（antisense technology)。隨著反義技術(shù)的不斷發(fā)展，從反義DNA、反義RNA，已發(fā)展到具有酶催化作用的核酶（ribozyme)和多靶位核酶（multi-targetribozyme)RNA分子，使反義分子的類型不斷增多。
繼發(fā)現(xiàn)核酶、反義RNA之后，近年有關(guān)小干擾RNA（21-25bp)及其所致的RNA干擾（RNA interference,RNAi)現(xiàn)象又成為研究熱點(diǎn)。由于小干擾RNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合后，可降解mRNA，因此，可有效地抑制靶基因的表達(dá)。RNAi是宿主對外源核酸（如病毒基因)侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)，將為病毒感染性疾病的防治提供新手段。
反義DNA、反義RNA、單靶位核酶和多靶位核酶識別底物DNA/RNA分子都是基于堿基配對原則，在基因水平阻斷病毒基因復(fù)制和表達(dá)，因此，反義技術(shù)的特異性很高，對宿主細(xì)胞幾乎無損害作用。反義技術(shù)抗病毒感染的機(jī)制主要包括以下幾個方面：
阻斷或抑制病毒DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄 在病毒DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中，雙鏈DNA可解離成為單鏈狀態(tài)。反義DNA片段可與DNA雙鏈中的一股以堿基配對方式，形成DNA三聚體（triplet)結(jié)構(gòu)，從而抑制或阻斷DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抗病毒治療的目的。
阻斷RNA的轉(zhuǎn)運(yùn) 病毒的基因組進(jìn)入細(xì)胞核中，與細(xì)胞基因組整合或呈游離狀態(tài)。病毒基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需透過核膜轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，經(jīng)加工后進(jìn)行翻譯。如果病毒的RNA不能正常有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，就不能進(jìn)行復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后加工。未經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工的mRNA是不能正常進(jìn)行翻譯的。反義RNA亦在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，它可與病毒的RNA互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)生RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)扣留。
阻斷RNA的轉(zhuǎn)錄后加工 病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA在形成翻譯復(fù)合體之前，需要進(jìn)行一系列的加工修飾過程，例如，乙型肝炎病毒（HBV)的mRNA需要在多個位點(diǎn)上進(jìn)行剪切，以形成結(jié)構(gòu)和大小合適的翻譯模板RNA，3'端加poly（A)。反義RNA與病毒的RNA結(jié)合，可以阻斷這種轉(zhuǎn)錄后的加工過程，故稱之為轉(zhuǎn)錄后的加工抑制。
翻譯抑制 病毒mRNA與核糖體RNA形成翻譯復(fù)合體后才能進(jìn)行翻譯，其結(jié)合方式主要有2種：
1．帽狀結(jié)構(gòu)依賴性的掃描機(jī)制（cap-dependentscanning mechanism，CDSM) 又稱為滑動機(jī)制，核糖體RNA與mRNA的帽狀結(jié)構(gòu)結(jié)合與扣留，則順著模板mRNA從5'端向3'端方向掃描或滑動，當(dāng)遇到第一個翻譯的起始密碼子，就可啟動翻譯過程。直到遇到終止密碼子時，翻譯才會終止。
2．內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internalribosome entry site，IRES)方式 即帽狀結(jié)構(gòu)非依賴性的翻譯過程。核糖體RNA直接尋找并結(jié)合IRES序列，形成翻譯復(fù)合體，從一個合適的起始密碼子開始翻譯。
以上二種翻譯機(jī)制都需要核糖體RNA與起始密碼子上游的RNA模板序列相結(jié)合。如果反義分子與此部位上的模板核苷酸首先結(jié)合，就可阻斷翻譯復(fù)合體的形成，進(jìn)而抑制或阻斷病毒蛋白的翻譯。
破壞病毒RNA 反義技術(shù)破壞病毒的RNA有2種主要機(jī)制：
1．反義分子與靶mRNA鏈結(jié)合后，可激活內(nèi)源性的核糖核酸酶如RNaseH等。RNase H可識別、分解DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子中的RNA鏈，以破壞病毒的逆轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯及轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
2．核酶RNA分子可利用其活性中心兩側(cè)的側(cè)翼序列與作為底物的靶RNA結(jié)合，并能識別特異的核苷酸序列，將其裂解。如果設(shè)計(jì)的是多靶位核酶RNA分子，就可在多個位點(diǎn)上將底物RNA分子進(jìn)行切割，成為多個碎片。
反義核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON)包括反義DNA和反義RNA，前者是指人工合成的、與靶基因某一區(qū)段互補(bǔ)的、正�；蚪�(jīng)化學(xué)修飾的DNA片段，后者是指一類能與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA分子，可參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控，抑制特異基因的表達(dá)。反義RNA可在體內(nèi)表達(dá)或體外合成。反義寡核苷酸作為基因表達(dá)的反向抑制劑，應(yīng)具備足夠的穩(wěn)定性；對目的基因的選擇性；對細(xì)胞的通透性及靶向性，故應(yīng)在化學(xué)修飾、序列選擇、靶向轉(zhuǎn)運(yùn)等方面加以完善。
近年來，國內(nèi)外已有大量應(yīng)用ASON在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中成功地抑制人類免疫缺陷病毒（HIV)、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、Rous肉瘤病毒等感染的研究報(bào)道。
在AIDS的基因治療中，通過表達(dá)有關(guān)的互補(bǔ)核酸，以抑制HIV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，應(yīng)用內(nèi)源性合成的tat、rev、vpu、gag或5'端的引物結(jié)合位點(diǎn)等基因的反義RNA，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系和CD4＋淋巴細(xì)胞中均可抑制HIV-1感染。Tat蛋白是一種反式激活的轉(zhuǎn)錄因子，可與HIV-1長末端重復(fù)序列TAR位點(diǎn)（tat效應(yīng)元件)結(jié)合，使HIV-1基因表達(dá)升高1000倍以上，因此，利用針對TAR的反義RNA可作為一種有效的HIV轉(zhuǎn)錄抑制劑。例如，針對HIV-1TAR序列，構(gòu)建表達(dá)反義TAR的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將重組體轉(zhuǎn)染Sup T1細(xì)胞后，再用HIV-1病毒株攻擊，Sup T1細(xì)胞內(nèi)HIV-1病毒顆粒數(shù)量明顯減少。又如，將反義tat基因?qū)肟乖禺愋訡D4＋淋巴細(xì)胞，同樣可以抑制HIV的復(fù)制。
有學(xué)者構(gòu)建了一種新的反義類型，即反義tRNA，直接針對HIV-1tat基因第一個編碼外顯子核苷酸序列（5 924～5 943 nt)，該序列在大多數(shù)HIV-1分離株中高度保守。不改變tRNA的四環(huán)結(jié)構(gòu)而將抗tat反義序列插入到一個tRNA骨架中，再用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將此反義tRNA導(dǎo)入Jurkat細(xì)胞株，結(jié)果能有效作用于靶位，表現(xiàn)出明顯的抗HIV從頭感染（denovoinfection)。這是首次將反義tRNA用于HIV-1感染的基因治療。該策略具有轉(zhuǎn)錄體為聚合酶Ⅲ啟動子所驅(qū)動、反義RNA穩(wěn)定性高等顯著特點(diǎn)。
核酶（ribozyme)是一類具有雙重特性的RNA分子，一是能識別特異的靶RNA序列并與之結(jié)合，具有反義核酸的特性；二是具有酶活性，能通過特異性位點(diǎn)切割降解靶RNA序列。核酶比反義RNA的阻斷活性至少高100倍，它作為抗病毒基因治療的新型分子，已受到廣泛的重視，成為抗病毒基因治療研究中重要的探索方向。
從分子結(jié)構(gòu)上，核酶主要分為錘頭狀核酶和發(fā)夾狀核酶，兩者均能催化異體靶RNA的剪切反應(yīng)。錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)簡單，長約30bp，含有一個保守的活性中心和與底物RNA互補(bǔ)的側(cè)翼序列，易于人工設(shè)計(jì)，所以目前合成的大多是錘頭狀核酶。
在基因治療中，主要是在體外設(shè)計(jì)核酶的編碼基因，以逆轉(zhuǎn)錄病毒等載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，再通過核酶切割靶RNA分子，從而阻斷病毒特定基因的表達(dá)（圖11-10)。這一策略經(jīng)較為周密的細(xì)胞及動物水平的系統(tǒng)研究，已用于抗HIV基因治療的臨床試驗(yàn)，并對肝炎病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、鼠白血病病毒等進(jìn)行了研究。
根據(jù)HIV調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因的特點(diǎn)，經(jīng)人工設(shè)計(jì)與核酶隨機(jī)文庫篩選，已獲得多種發(fā)夾狀或錘頭狀的抗HIV-1核酶，其中一些核酶已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)階段。例如，將靶向HIV-1前導(dǎo)序列U5區(qū)（連接mRNA帽狀結(jié)構(gòu)的起始區(qū))和pol基因的兩種發(fā)夾狀核酶的基因克隆到Moloney小鼠白血病病毒（MoMLV)中，轉(zhuǎn)染AIDS患者CD4＋T淋巴細(xì)胞，然后自體回輸給病人。在對3例病人為期9個月的研究中，觀察了治療方案的安全性、轉(zhuǎn)染核酶的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)的存活期和動力學(xué)指標(biāo)、核酶在體內(nèi)的表達(dá)水平，以及核酶對體內(nèi)病毒載量、病毒mRNA表達(dá)、CD4＋T淋巴細(xì)胞水平的影響，結(jié)果表明，給病人回輸轉(zhuǎn)染了核酶的自體淋巴細(xì)胞是安全的；在回輸初期，內(nèi)源性CD8＋細(xì)胞、NK細(xì)胞和自體回輸?shù)腡細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)雜的重新分布。又如，采用靶向HIV復(fù)制過程中關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白Tat的錘頭狀核酶，通過MoMLV將核酶導(dǎo)入自體CD34+造血干細(xì)胞，再回輸給病人，結(jié)果是安全、有效的。
HIV-1基因組的高度變異性是核酶所面臨的最大挑戰(zhàn)。變異如果發(fā)生在核酶的切割位點(diǎn)上，則形成抗核酶的突變株。因此，對于HIV-1這樣一個長達(dá)近萬個堿基且突變率極高的逆轉(zhuǎn)錄病毒，在核酶的設(shè)計(jì)中必須注意以下幾點(diǎn)：
1．選擇高度保守的RNA切割位點(diǎn) 目前已分別設(shè)計(jì)出針對HIV-1 RNA中LTR、gag、tat、pol、env、vif、nef等不同高保守序列的核酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。例如，選擇HIV-1基因組中高度保守的tat或tat＋rev基因作為靶RNA，設(shè)計(jì)錘頭狀核酶，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將核酶基因轉(zhuǎn)入人T淋巴細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)核酶的T細(xì)胞能成功地抵抗HIV-1感染。
2．多切割位點(diǎn)同時作用 鑒于多個靶位點(diǎn)同時突變的頻率比單個點(diǎn)突變的頻率要小得多，且只要有一個切割有效就能破壞HIV-1RNA，因此聯(lián)合應(yīng)用作用于不同靶點(diǎn)的連接型或獨(dú)立型核酶，可大大提高切割效率，對于消除HIV-1高度變異帶來的不利影響是非常有效的。
3．核酶基因可與其它具有治療作用的基因協(xié)同發(fā)生抗HIV-1作用。
可以相信，隨著運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄載體技術(shù)的提高，對核酶進(jìn)行化學(xué)修飾，及陽離子脂質(zhì)體導(dǎo)入技術(shù)的發(fā)展，核酶抗病毒基因治療途徑將發(fā)揮更大的作用。
除了上述直接針對病毒的基因治療研究外，通過導(dǎo)入病毒抗原基因誘生保護(hù)性抗體，或?qū)朊庖哒{(diào)節(jié)因子基因及其誘導(dǎo)基因等，提高宿主的免疫功能，特別是CTL的殺傷活性，清除受病毒感染細(xì)胞等，是發(fā)展抗病毒基因治療的另一有效手段。主要方法有：體內(nèi)直接注射DNA、抗原基因?qū)�、自殺基因�(qū)爰盎蛱娲腃TL過繼免疫等。目的基因在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)是實(shí)現(xiàn)抗病毒治療的關(guān)鍵，應(yīng)從載體和啟動子的優(yōu)化、轉(zhuǎn)送基因方法的改進(jìn)等方面進(jìn)行深入研究。
直接注射DNA又稱核酸免疫（nucleicacidimmunization)，是近年來從基因治療研究中衍生而發(fā)展的一個新領(lǐng)域（見第13章)。病毒核酸免疫是將病毒基因直接輸入病人組織，以模擬自然感染而激發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答。核酸疫苗可為裸露的閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA或非復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體形式。目前正在研制流感病毒、單純皰疹病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、狂犬病病毒等核酸疫苗。
HBV的核酸疫苗采用HBsAg和HBcAg的基因，分別構(gòu)建表達(dá)載體，或構(gòu)建兩種蛋白的融合基因，它們均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。HCV的DNA疫苗研究主要集中在衣殼蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3)等編碼基因區(qū)，但也有少數(shù)研究采用包膜區(qū)E1和E2區(qū)進(jìn)行基因免疫。
HIV的核酸免疫主要集中在編碼包膜糖蛋白的基因區(qū)。給多種動物注射HIV-1env、tat、rev基因，結(jié)果證實(shí)動物組織內(nèi)能表達(dá)HIV蛋白，激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。將攜帶有HIV env和rev基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體直接肌肉注射小鼠、獼猴和狒狒，三種動物產(chǎn)生特異針對gp120和Rev蛋白的MHCⅠ類分子限制的CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)，CTL反應(yīng)可長時間存在。由于rev基因的高度保守性，使針對Rev蛋白決定簇的特異性免疫應(yīng)答能交叉作用于不同的HIV-1臨床分離株，因而具有特別重要意義。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)這種DNA免疫模式用于HIV感染者臨床試驗(yàn)。核酸免疫的最大優(yōu)點(diǎn)是對變異迅速的病原微生物提供交叉防御作用，因此，有望研制出對HIV變異株有效的核酸疫苗，用于HIV感染的防治。
病毒的多種抗原成分可刺激宿主產(chǎn)生一種或多種不同類型的抗體，具有免疫保護(hù)作用，這與免疫清除病毒的過程密切相關(guān)。因此，將誘生保護(hù)性抗體的抗原編碼基因?qū)肴梭w細(xì)胞并進(jìn)行高效表達(dá)，也是抗病毒基因治療的一條重要途徑。
研究表明，HIV包膜糖蛋白是誘發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原成分，可作為預(yù)防HIV感染的疫苗。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將HIV-1 gp120基因?qū)胄∈罄w維母細(xì)胞系，然后用轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫同源小鼠，結(jié)果獲得MHC限制性的、針對gp120的特異性CTL細(xì)胞。將這些CTL輸給帶有表達(dá)HIV-1衣殼抗原的患腫瘤小鼠，可觀察到這些腫瘤細(xì)胞被CTL特異性殺傷，同時受免疫小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生抗gp120特異性中和抗體，抑制受感染的T淋巴細(xì)胞形成病毒合胞體，阻止HIV擴(kuò)散。進(jìn)一步用鼠和靈長類動物的自體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后回輸?shù)襟w內(nèi)，也獲得同樣的治療效果。以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的HIV包膜蛋白基因的轉(zhuǎn)移及表達(dá)保護(hù)性抗體的基因治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
將針對病毒某些組分的特異性抗體基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體可滅活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞漿和核內(nèi)的靶蛋白的活性，從而抑制病毒的增殖。這類抗體稱為細(xì)胞內(nèi)抗體（intracellular antibodies)，其構(gòu)建方法包括雜交瘤技術(shù)和抗體庫技術(shù)。
HIV通過包膜糖蛋白gp120與CD4＋細(xì)胞表面的CD4分子、輔助受體相互作用而侵入細(xì)胞，造成CD4＋細(xì)胞的數(shù)量減少，甚至完全喪失。因此，保護(hù)CD4＋細(xì)胞不受感染的策略之一是，導(dǎo)入HIV-1抗體的基因，表達(dá)特異性抗體，中和HIV的感染性。例如，將抗gp120抗體基因克隆到LTR啟動子部位，可因HIV感染而誘導(dǎo)表達(dá)。抗gp120單鏈抗體可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與CD4分子競爭結(jié)合HIV-1gp120，并阻止病毒向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制HIV的復(fù)制。該單鏈抗體由重鏈的引導(dǎo)序列、可變區(qū)與輕鏈的可變區(qū)通過連接子融合而成。由于單鏈抗體在沒有相應(yīng)的另一條鏈的情況下將滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，故可將與該單鏈抗體結(jié)合的gp120引到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而減少其表達(dá)。
將HIV-1的cDNA與Gag單鏈抗體基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Gag蛋白表達(dá)水平并未改變，但胞內(nèi)則無完整病毒顆粒存在。此外，針對Tat蛋白、Rev蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、內(nèi)膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)抗體均可有效地干擾HIV-1的增殖。
以上結(jié)果提示，以HIV抗體的編碼基因作為目的基因?qū)嵤┗蛑委熓且粭l很有希望的途徑，尤其是在HIV生命周期的不同點(diǎn)阻斷其復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)抗體聯(lián)合療法對AIDS的治療更為有效。不過，HIV基因可編碼多種與致病性有關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，它們作為抗原可激發(fā)宿主產(chǎn)生不同的抗體。為優(yōu)化細(xì)胞內(nèi)抗體表達(dá)的抗HIV基因治療策略，獲得更為理想的治療效果，應(yīng)選擇病毒生存所必需的表位（epitope)，以減少HIV逃逸突變的發(fā)生；同時，須對各種抗體抑制或阻斷HIV感染的效果進(jìn)行比較，以找到細(xì)胞內(nèi)抗體的最佳靶點(diǎn)。
免疫因子特別是淋巴因子基因的導(dǎo)入，不僅是抗腫瘤的重要內(nèi)容，同時也是抗病毒感染基因治療的重要內(nèi)容。利用淋巴因子轉(zhuǎn)基因表達(dá)是基因治療在病毒性疾病中的一個重要應(yīng)用和研究方向。
免疫因子的導(dǎo)入對HIV的感染有直接抑制作用。例如，將人α2干擾素（IFN-α2)基因重組在HIV LTR的啟動子下游，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞系，分泌的IFN-α2水平在50～150u /ml，可明顯抑制HIV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。而用相同劑量的外源重組IFN-α2則不能產(chǎn)生類似效果，提示體內(nèi)產(chǎn)生的IFN-α2與體外重組的IFN-α2的抗病毒機(jī)制不同。如果在上述體系中加入HIV啟動子的反式激活劑Tat蛋白或者感染HIV，則可使IFN-α2的表達(dá)量分別提高到400u /ml和1000 u/ml。這一系統(tǒng)的另一個特點(diǎn)是，在反式激活因子不存在時，目的基因表達(dá)處于低水平，以減少因目的基因的持續(xù)高水平表達(dá)可能給宿主帶來的不良反應(yīng)。同時，在受到病毒攻擊時，病毒提供的反式激活因子則促進(jìn)目的基因的高水平表達(dá)，類似于人體生理的調(diào)控狀態(tài)。
其它種類的淋巴因子，特別是白細(xì)胞介素類的基因也是提高宿主免疫力、抵抗病毒感染的重要治療手段。
1988年Friedman等發(fā)現(xiàn)，單純皰疹病毒（HSV)的反式激活蛋白VP16的缺失或截短突變體（truncatedform)具有明顯的抗HSV效應(yīng)。截短突變體缺少野生型VP16羧基末端的78aa，仍能與野生型的HSV DNA結(jié)合，但失去了反式激活效應(yīng)。能穩(wěn)定表達(dá)該突變體的細(xì)胞對HSV的復(fù)制具有明顯的抑制作用，即產(chǎn)生了免疫力，提示它可與病毒基因組中的順式激活序列結(jié)合，從而干擾相應(yīng)的野生型蛋白的激活作用。因此，Baltimore于1988年首先提出“細(xì)胞內(nèi)免疫（intracellularimmunization)”這一概念，即將人工構(gòu)建的一個重組基因?qū)胍赘屑?xì)胞內(nèi)，表達(dá)病毒基因的反義核酸或病毒蛋白的突變體，以便有效地干擾野生型病毒的增殖。
抗HSV基因治療的策略同樣適用于抗HIV的基因治療。HIV同時具有反式和順式調(diào)節(jié)機(jī)制，HIV-1生命周期中必需的調(diào)節(jié)蛋白（Rev、Tat)和結(jié)構(gòu)蛋白（Gag、Env)都有可能作為設(shè)計(jì)細(xì)胞內(nèi)免疫的目的基因表達(dá)產(chǎn)物。目前，抗HIV基因治療的細(xì)胞內(nèi)免疫法主要包括：HIV蛋白的修飾和RNA抑制劑的應(yīng)用，前者主要有調(diào)節(jié)蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白修飾，后者主要包括RNA誘捕、反義RNA及核酶等技術(shù)。
（一)RNA誘捕
RNA誘捕就是通過某些與病毒調(diào)節(jié)蛋白具有同源性的RNA超表達(dá)，以螯合調(diào)節(jié)蛋白而抑制其調(diào)節(jié)功能，從而對病毒的復(fù)制和表達(dá)產(chǎn)生強(qiáng)有力的抑制作用。誘餌或引誘劑（decoys)方案的設(shè)計(jì)和應(yīng)用要求誘餌RNA分子處于量的優(yōu)勢，即必須處于“過表達(dá)”狀態(tài)。
HIV復(fù)制與表達(dá)的調(diào)控過程涉及極為復(fù)雜的蛋白-核酸之間的相互作用，其中tat、rev是HIV復(fù)制的兩個主要調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)產(chǎn)物Tat和Rev分別與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)TAR（tatresponsive element)和Rev效應(yīng)元件（rev responsive element，RRE)結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄（參見第11章)。因此，Tat-TAR和Rev-RRE在HIV生命周期中顯得十分重要，已成為HIV基因治療研究中的熱點(diǎn)之一。
應(yīng)用RRE和TAR誘餌抗HIV基因治療的基本思路是：在HIV感染的靶細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)一種與TAR或RRE相類似的短RNA，這些誘餌競爭性結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白Tat與Rev，阻止調(diào)節(jié)蛋白與病毒基因組上的相應(yīng)序列（TAR或RRE)結(jié)合，從而抑制HIV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，將HIV-1的TAR或RRE的基因插入到攜帶polⅢ（tRNAmet)啟動子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后轉(zhuǎn)染人T細(xì)胞系CEM，獲得TAR和RRE超表達(dá)，結(jié)果在帶有這些基因的CEM T細(xì)胞中，HIV-1的表達(dá)受到抑制。
為了提高Tat序列的誘捕效應(yīng)，可構(gòu)建依賴于HIV的誘導(dǎo)性載體，該載體表達(dá)的多聚TAR（polyTAR)可與病毒TAR RNA競爭結(jié)合Tat蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制。多聚TAR的表達(dá)受HIV LTR調(diào)控，活性依賴于HIV Tat蛋白的存在。隨著TAR串聯(lián)子數(shù)量的增加，病毒Tat介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制率隨之增加，當(dāng)TAR串聯(lián)數(shù)達(dá)50時，抑制率高達(dá)90%以上。
與反義RNA和核酶不同的是，RNA誘餌不受HIV變異的影響，因?yàn)門AR和RRE在不同HIV毒株中十分保守。不過，使用這些特定的誘餌RNA作為抗病毒的手段也可阻止與TAR或RRE相關(guān)的細(xì)胞因子，因此，TAR或RRE在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有可能產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)而影響細(xì)胞功能。為了降低可能出現(xiàn)的細(xì)胞毒性作用，可設(shè)計(jì)僅含13bp的最小化RRE誘餌，保留其與Rev結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，抑制HIV的復(fù)制，但不能與細(xì)胞因子結(jié)合。
（二)調(diào)節(jié)蛋白修飾
HIV某些調(diào)節(jié)蛋白經(jīng)突變或修飾后，失去調(diào)節(jié)功能，但可與天然病毒蛋白競爭結(jié)合其目標(biāo)位點(diǎn)，從而干擾病毒的正常復(fù)制，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。HIV的調(diào)節(jié)蛋白主要是Tat、Rev，其中Tat為反式激活蛋白，能結(jié)合到病毒RNA的tat序列上，促進(jìn)細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ?qū)IV前病毒的轉(zhuǎn)錄；Rev蛋白則在啟動HIV病毒結(jié)構(gòu)蛋白和蛋白酶的合成過程中起關(guān)鍵作用。因此，可將突變修飾后的調(diào)節(jié)蛋白基因?qū)際IV感染的靶細(xì)胞中，表達(dá)相應(yīng)的顯性突變蛋白，干擾HIV感染和復(fù)制過程，使細(xì)胞免受HIV感染。
Tat蛋白突變株 通過缺失tat基因?qū)е缕渚幋a產(chǎn)物Tat蛋白無RNA結(jié)合或核定位特性，但仍保留活性結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的Tat蛋白可抑制HIV的基因表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)雙功能RNA（多聚tat和反義tat)的抗tat基因，已成功地用于螯合Tat蛋白的功能及阻斷tatmRNA的翻譯。據(jù)報(bào)道，tat突變體在原代細(xì)胞中能控制HIV-1的復(fù)制，可在體外感染HIV的正常人外周血單核細(xì)胞（PBMC)或者經(jīng)激活的HIV-1陽性病人的PBMC中觀察到這一現(xiàn)象。
tat突變體的抗病毒作用限于低病毒載量，提示可望用于無癥狀期的HIV感染者的治療，以控制細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制而阻斷病毒的傳播。
Rev蛋白突變株 在調(diào)節(jié)蛋白中，對突變的Rev蛋白M10研究較多。運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建Rev突變體Rev M10（Leu78Glu79→Asp78Leu79)，改變該蛋白C末端富含亮氨酸結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，使Rev蛋白喪失其調(diào)節(jié)功能，但不影響其與Rev 效應(yīng)元件RRE的結(jié)合特性和形成多聚體的功能。野生型的Rev可形成多聚體，與RRE結(jié)合后，通過其調(diào)節(jié)區(qū)域促進(jìn)未經(jīng)剪接和經(jīng)單一剪接的病毒mRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿中，以便表達(dá)病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白。而突變的RevM10則可與野生型Rev競爭性與RRE結(jié)合，故HIV的復(fù)制和表達(dá)受到抑制。
利用Moloney鼠白血病病毒為載體，將RevM10基因?qū)氲饺薚細(xì)胞系CEM，可穩(wěn)定表達(dá)Rev M10，并能抵抗HIV-1感染；將Rev M10基因?qū)肴嗽鶷細(xì)胞，亦可促進(jìn)該細(xì)胞獲得抗HIV感染的能力。
新近報(bào)道，用構(gòu)建的反式顯性Rev突變體（transdominantRev，Rev-Td)插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，分別轉(zhuǎn)染Sup T1細(xì)胞株和正常CD4＋T細(xì)胞，然后用不同的HIV-1病毒（包括HIV-1IHB和MN株及病人初代分離株)攻擊，結(jié)果這些細(xì)胞表達(dá)Rev突變體（包括點(diǎn)突變和讀框移位)后，HIV-1 gag mRNA的轉(zhuǎn)錄和病毒的復(fù)制均顯著降低，細(xì)胞不被病毒破壞。進(jìn)一步與反義TAR及反義Tat/ Rev轉(zhuǎn)染的Sup T1細(xì)胞株醫(yī)學(xué)三基和正常人CD4＋T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)Rev-Td能保護(hù)70%細(xì)胞免受HIV-1的感染，比反義RNA的保護(hù)作用（30%～50%)強(qiáng)。應(yīng)用RevM10突變體等對HIV感染者進(jìn)行臨床治療的計(jì)劃已在進(jìn)行，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)移抗病毒基因可用于AIDS病人的免疫重建。
（三)結(jié)構(gòu)蛋白修飾
通過結(jié)構(gòu)蛋白的修飾亦可顯著干擾HIV前病毒的復(fù)制。Gag蛋白在成熟病毒顆粒中以高度多聚化形式存在，該結(jié)構(gòu)的缺失導(dǎo)致HIV不能復(fù)制，因此，將Gag蛋白突變體基因?qū)胨拗骷?xì)胞后可獲得表達(dá)并抵抗HIV感染。
Env蛋白則是另一被修飾的靶子。例如，將HIV的gp41跨膜蛋白的第2位纈氨酸用谷氨酸取代，構(gòu)建成Env突變體，再將該突變體基因?qū)隩細(xì)胞系內(nèi)，結(jié)果顯示，這些細(xì)胞系不僅可抵抗野生型HIV-1引起的細(xì)胞病變效應(yīng)，而且降低了HIV前病毒的復(fù)制，其機(jī)制可能是通過干擾包膜糖蛋白多聚體與受體復(fù)合物的疏水性相互作用。又如，gp120上與CD4分子結(jié)合的序列被切除后，Env突變體將不再結(jié)合CD4分子，并可干擾野生型HIV的復(fù)制。
值得注意的是，突變蛋白的作用是抑制病毒表達(dá)或干擾病毒成熟，其發(fā)揮效應(yīng)的階段是在病毒感染整合以后，對感染早期沒有抑制效應(yīng)。由于表達(dá)的是外源性蛋白，有可能激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生CTL而破壞突變蛋白的表達(dá)細(xì)胞。
設(shè)計(jì)清除病毒感染細(xì)胞而非單純干擾病毒的復(fù)制和表達(dá)過程是基因治療研究的另一條重要思路，因此，導(dǎo)入自殺基因（suicide gene)以清除病毒感染細(xì)胞在基因治療中占有重要地位。其基本策略是，將自殺基因?qū)爰?xì)胞中，當(dāng)沒有病毒感染時，自殺基因不表達(dá)，對正常細(xì)胞無損害作用；一旦受到病毒攻擊，病毒復(fù)制表達(dá)過程中的早期蛋白成分為自殺基因的表達(dá)提供反式激活劑，從而阻斷病毒復(fù)制與表達(dá)、病毒顆粒的裝配與成熟或在細(xì)胞之間擴(kuò)散。
引起細(xì)胞自殺的基因種類較多，如某些病毒或真菌的一些酶類基因、白喉毒素基因、促進(jìn)藥物代謝和轉(zhuǎn)換的基因、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因等。自殺基因的導(dǎo)入可以有效地殺傷受病毒感染的細(xì)胞，但怎樣保證細(xì)胞自殺的范圍僅限于病毒感染的細(xì)胞，而對于正常細(xì)胞無不良反應(yīng)是設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。
HIV能逃逸宿主免疫系統(tǒng)的一個重要原因在于HIV進(jìn)入CD4＋淋巴細(xì)胞內(nèi)增殖，當(dāng)病毒顆粒成熟釋放后，可以從宿主細(xì)胞膜上獲得保護(hù)性外膜，從而再次逃脫宿主的免疫監(jiān)視。由于宿主自身的CTL反應(yīng)不能完全清除受病毒感染的CD4＋淋巴細(xì)胞，而且隨著病程的發(fā)展，CTL反應(yīng)不斷減弱。因此，可利用自殺分子殺傷受病毒感染的淋巴細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)未成熟的病毒顆粒失去宿主細(xì)胞膜的保護(hù)，從而易于被機(jī)體及時清除。最常用的自殺基因有單純皰疹病毒（HSV)脫氧胸苷激酶（thymidinekinase，TK)基因和細(xì)菌毒素如白喉毒素基因。
脫氧胸苷激酶基因 HSV-tk基因與前體藥物丙氧鳥苷（ganciclovir，GCV)聯(lián)合是目前應(yīng)用最廣的自殺基因系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，將單純皰疹病毒脫氧胸苷激酶基因（HSV-tk)與潮霉素（hygromycin)抗性基因重組后，經(jīng)載體導(dǎo)入HIV-1特異的CD8＋T細(xì)胞，在體外擴(kuò)增后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。HSV-tk基因所編碼的TK酶可使無毒性的GCV磷酸化成核苷類似物GCV-P，后者在細(xì)胞酶作用下轉(zhuǎn)變成GCV-PP和GCV-PPP，GCV-PPP是毒性極強(qiáng)的三磷酸核苷類似物，它作為底物摻入到新合成的DNA鏈中，使DNA斷裂且抑制DNA聚合酶活性，從而阻斷DNA合成，導(dǎo)致分裂期的受病毒感染細(xì)胞死亡，達(dá)到治療HIV-1感染的目的。當(dāng)輸入攜帶該融合基因的CTL后，一旦出現(xiàn)毒性副作用，即可給予GCV，殺死輸入的細(xì)胞，以保證安全。
可誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用，為“自殺基因”準(zhǔn)確殺傷HIV感染靶細(xì)胞創(chuàng)造了條件。將可受Tat誘導(dǎo)的TK表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入CD4＋T淋巴細(xì)胞，tk基因可在受HIV感染的細(xì)胞中獲得高水平表達(dá)，在TK底物存在的情況下，可導(dǎo)致HIV感染細(xì)胞死亡和增殖抑制，阻止病毒在細(xì)胞間的傳播。運(yùn)用腺病毒載體構(gòu)建相似的HSV-tk基因表達(dá)載體，用該重組載體轉(zhuǎn)染有Tat表達(dá)的T細(xì)胞和Hela細(xì)胞系，當(dāng)再給予GCV時可使這些細(xì)胞死亡。
HSV-tk/GCV系統(tǒng)不僅能殺滅表達(dá)HSV-TK的病毒感染細(xì)胞，也能誘導(dǎo)相鄰的不表達(dá)tk基因的細(xì)胞死亡，這一現(xiàn)象稱為“旁觀者效應(yīng)”（bystander effect)，從而擴(kuò)大了自殺基因的殺傷作用，同時增強(qiáng)了轉(zhuǎn)染效率。“旁觀者效應(yīng)”的產(chǎn)生機(jī)制可能是，轉(zhuǎn)染自殺基因的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷性物質(zhì)，通過細(xì)胞間隙連接（gapjunction)傳遞到臨近細(xì)胞，引起死亡。亦可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。
白喉毒素基因 自殺基因還包括編碼細(xì)胞毒素的基因，當(dāng)該基因表達(dá)時細(xì)胞即被殺死，應(yīng)用白喉毒素能實(shí)現(xiàn)該目的。白喉毒素由A、B兩個亞基組成，A鏈?zhǔn)嵌舅氐亩拘圆课�，可�?dǎo)致細(xì)胞因蛋白質(zhì)合成障礙而死亡；B鏈?zhǔn)嵌舅氐慕Y(jié)合部位，與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合。
通過構(gòu)建編碼白喉毒素A鏈基因的載體，用HIV的LTR控制基因的表達(dá)，同時表達(dá)結(jié)構(gòu)中含有TAR序列及一段負(fù)調(diào)控序列，使A鏈基因的表達(dá)依賴于Tat和Rev雙重蛋白的作用。體外實(shí)驗(yàn)證明，HIV敏感的TH9細(xì)胞系受該載體轉(zhuǎn)染后，對HIV毒株感染的保護(hù)力可持續(xù)59d，受感染的細(xì)胞群體產(chǎn)生病毒的能力大大下降，甚至用PCR方法也檢測不到病毒的存在，說明保護(hù)力是完全的。這是由于在病毒感染早期產(chǎn)生的Tat和Rev的作用，激活并表達(dá)白喉毒素，將受感染細(xì)胞殺死，因而不能產(chǎn)生足夠的病毒傳播至其它細(xì)胞�？梢姡�(xì)胞毒素基因治療是一種很有前途的抗HIV基因治療方法。
依賴于Tat和Rev雙重蛋白的白喉毒素基因載體有二大優(yōu)點(diǎn)：第一，毒素的表達(dá)是Tat和Rev雙重依賴性的，在HIV感染的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染該載體能造成HIV復(fù)制的實(shí)質(zhì)性抑制；第二，白喉毒素A基因表達(dá)的基礎(chǔ)水平顯著下降，降低了對正常細(xì)胞的毒性作用，提高了治療的安全性。
抗病毒藥物治療是抗病毒治療中的一個重要組成部分。由于病毒必須侵入宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制才顯示其生命活性和致病性，因此，設(shè)計(jì)抗病毒藥物或制劑的策略可分別從病毒感染細(xì)胞的吸附與穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放等不同環(huán)節(jié)篩選不同藥物。目前，抗病毒藥物主要包括化療藥物和干擾素，其中化療藥物可分為核苷類似物和非核苷類似物等。
核苷類化合物是最早用于臨床的抗病毒藥物，其作用機(jī)制主要有：
阻止病毒核酸鏈的延伸 DNA病毒與RNA病毒的復(fù)制均需要依賴宿主細(xì)胞提供核苷作為病毒DNA或RNA合成的原料。病毒能夠利用自身的核糖核酸還原酶，將細(xì)胞內(nèi)RNA水解，再利用自身胸腺嘧啶核苷激酶將胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)化為單磷酸胸腺嘧啶核苷，在細(xì)胞激酶作用下將單磷酸核苷轉(zhuǎn)化為二磷酸和三磷酸核苷而被病毒利用。核苷類似物抗病毒藥物可作為病毒復(fù)制的原料，在病毒特異的胸腺核苷激酶或類似酶的催化下，轉(zhuǎn)化為磷酸化的核苷類似物而摻入合成的病毒DNA或RNA鏈中。由于核苷類似物缺少3＇羥基，或因其它修飾而不能使正在合成的病毒核酸鏈繼續(xù)延伸，阻斷病毒核酸的復(fù)制，故這些核苷類藥物被稱為“鏈終止劑”（chainterminitor)。
抑制病毒DNA或RNA聚合酶 許多核苷類似物抗病毒藥物與細(xì)胞內(nèi)三磷酸脫氧核苷或三磷酸核苷競爭結(jié)合病毒DNA或RNA聚合酶，干擾病毒聚合酶與病毒復(fù)制模板和引物的結(jié)合，進(jìn)而抑制病毒聚合酶的活性。
抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 某些核苷類似物可直接與病毒逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，抑制其活性。
核苷類似物抗病毒藥物主要用于皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的治療，某些藥物也用于治療HBV和HCV感染。該類藥物的代表是齊多夫定（ZDV)，是1987年獲美國FDA批準(zhǔn)的第一個治療AIDS的藥物。目前用于臨床的有：雙脫氧肌苷（ddI)、雙脫氧胞苷（ddC)、司他夫定（D4T)和拉米夫定（lamivudine，3TC)等。其中，拉米夫定亦用于乙型肝炎和丙型肝炎的治療。另外，丙氧鳥苷（ganciclovir)可用于巨細(xì)胞病毒和皰疹病毒感染，無環(huán)鳥苷（acyclovir)和碘尿苷（IDU)用于皰疹病毒感染。利巴韋林（ribavarin,商品名病毒唑)可抑制多種RNA和DNA病毒復(fù)制。
非核苷類似物抗病毒藥物是一類非競爭性抑制劑，共同特性是不需要經(jīng)過磷酸化，作用靶點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄過程。例如，通過與HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性中心或附近部位結(jié)合而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。該類藥物能夠高度專一性地抑制HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶，對HIV-2及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制作用很低或無作用，主要有奈韋拉平（nevirapine)、得拉維拉定（delavivadine)、雙吡啶氮（TIBO)、吡啶酮（pyridones)等。非核苷類似物與核苷類似物聯(lián)用對HIV-1復(fù)制的抑制有協(xié)同作用。
蛋白酶抑制劑，又稱肽類似物抑制劑，主要模擬多蛋白水解部位的構(gòu)型，在感染細(xì)胞內(nèi)與多蛋白競爭結(jié)合蛋白酶，從而抑制蛋白酶的活性。蛋白酶抑制劑主要作用于病毒感染晚期，抑制病毒顆粒的成熟，使細(xì)胞只能產(chǎn)生非感染性病毒顆粒，因此可阻斷病毒傳播。
1996年美國FDA批準(zhǔn)了3個蛋白酶抑制劑：利多那韋（ritonavir)、沙喹那韋（saquinavir)和印地那韋（indinavir)。這些藥物可減少病毒載量，增加CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)，主要用于HIV晚期感染者，單藥療效不佳，常與核苷類似物聯(lián)用。目前已研制出第二代蛋白酶抑制劑如ABT-378、amprenavir、sc521、sc51和CGP61755、KNI-272等。
種類 干擾素（interferon，IFN)是目前最常用的抗病毒藥物之一，其抑制病毒復(fù)制具有廣譜性、間接性、種屬特異性及受體依賴性。IFN主要包括α、β和γ3種。IFN-α和IFN-β為Ⅰ型，IFN-γ為Ⅱ型。三種IFN的細(xì)胞來源、誘生物、分子結(jié)構(gòu)、抗原性和生物活性各不相同。IFN-α主要由腫瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，有耐酸和不耐酸二種。IFN-β主要由病毒核酸或其它外源性核酸刺激纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ由抗原特異性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。目前三種IFN的基因已被克隆和表達(dá)，臨床應(yīng)用的IFN多為基因工程產(chǎn)物。
抗病毒作用機(jī)制 IFN誘生劑作用于細(xì)胞，使IFN基因活化，轉(zhuǎn)錄表達(dá)IFN蛋白。表達(dá)的IFN分泌到細(xì)胞外，與其它細(xì)胞或自身細(xì)胞上的IFN受體系統(tǒng)結(jié)合后，發(fā)生配體受體復(fù)合物的內(nèi)在化和降解，激活未受感染靶細(xì)胞的抗病毒蛋白基因，表達(dá)各種抗病毒蛋白，使宿主細(xì)胞進(jìn)入抗病毒免疫狀態(tài)而免受病毒感染。與IFN抗病毒有關(guān)的蛋白質(zhì)主要有依賴RNA蛋白激酶（RNA-dependent protein kinase，PKR)、2＇-5′腺嘌呤核苷合成酶（2′-5′-AS)、磷酸二酯酶、Mx蛋白、MHC抗原、β-微球蛋白和腫瘤壞死因子受體等。其中，前四種介導(dǎo)的抗病毒作用尤為重要。
1．依賴RNA蛋白激酶 又稱eIF-2蛋白激酶，IFN和病毒雙鏈RNA協(xié)同活化細(xì)胞內(nèi)依賴RNA蛋白激酶。活化的蛋白激酶使細(xì)胞eIF-2的α亞單位磷酸化，干擾病毒蛋白質(zhì)的起始翻譯。
2．2′-5′AS IFN誘導(dǎo)2′-5′AS基因表達(dá)，病毒雙鏈RNA使2′-5′AS活化�；罨�2′-5′AS將細(xì)胞內(nèi)ATP轉(zhuǎn)化為許多寡腺苷酸，后者再激活細(xì)胞核酸內(nèi)切酶，使病毒mRNA降解。
3．磷酸二酯酶 能降解2′-5′A為ATP和AMP，同時也水解細(xì)胞內(nèi)tRNA末端的pCpCpA序列，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯。
4. Mx蛋白 是由IFN-α和IFN-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的75kDa蛋白，體外研究證實(shí)Mx蛋白能抑制流感病毒和水皰口腔炎病毒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。
除抑制病毒蛋白質(zhì)合成外，IFN對病毒感染的幾乎所有過程均有抑制作用，包括病毒的吸附、穿入、脫殼、復(fù)制、表達(dá)、裝配及釋放等。此外，IFN通過誘導(dǎo)細(xì)胞MHC抗原表達(dá)，增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)等方式間接抗病毒感染。
應(yīng)用 IFN主要用于治療HBV、HCV、HIV和皰疹病毒感染，其中IFN-α是目前唯一證實(shí)有效的慢性乙型病毒性肝炎的免疫治療藥物。治療初期，IFN主要通過誘導(dǎo)表達(dá)的抗病毒蛋白抑制病毒感染。用藥8～12周，患者常有轉(zhuǎn)氨酶的暫時升高，但血清病毒復(fù)制指標(biāo)的滴度下降，與IFN調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)引起的抗病毒作用有關(guān)。應(yīng)用IFN治療HBV和HCV感染的臨床指征是：血清HBeAg、HBV-DNA和HCV-RNA中有一項(xiàng)陽性，或肝組織中HBcAg、HCV-RNA和HCV抗原中有一項(xiàng)陽性，患者處于肝功能代償期時，均可應(yīng)用IFN治療。
隨著免疫學(xué)的進(jìn)展，免疫調(diào)節(jié)劑及過繼免疫治療已被應(yīng)用于病毒感染性疾病的治療，目的是試圖提高宿主免疫功能，增強(qiáng)抗病毒能力，改善病情，清除或抑制病毒。在臨床上使用較多的免疫調(diào)節(jié)劑有短棒菌苗、左旋咪唑、轉(zhuǎn)移因子、特異性免疫核糖核酸、真菌多糖、胸腺素、細(xì)胞因子等。
胸腺素（thymosin)是胸腺上皮細(xì)胞合成的多肽激素。目前臨床應(yīng)用的有胸腺素F5（TF5)和胸腺素α1（Tα1)，后者的生物學(xué)活性較前者高10～1000倍。胸腺素?zé)o種屬特異性，其主要免疫作用有：連續(xù)誘導(dǎo)T細(xì)胞不同亞群的成熟和分化，調(diào)整B細(xì)胞功能；調(diào)節(jié)免疫平衡作用；增強(qiáng)成熟T細(xì)胞、NK細(xì)胞對抗原的刺激反應(yīng)，產(chǎn)生白細(xì)胞介素2、IFN等細(xì)胞因子。
作為一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，Tα1可明顯提高機(jī)體的免疫功能，近年已廣泛作為免疫增強(qiáng)劑，用于臨床治療各種免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤及病毒感染性疾病。
近年來，國內(nèi)外用胸腺素治療慢性病毒性肝炎取得一定效果。鑒于單用IFN治療慢性HBV、HCV感染收效甚微，用Tα1與IFN聯(lián)合治療慢性病毒感染具有能使患者獲得更有效的組織學(xué)改善、病毒載量下降明顯、副作用較少等優(yōu)點(diǎn)。
許多細(xì)胞因子參與機(jī)體抗病毒免疫機(jī)制，其中最重要的是IL-2、IL-12 、IFN-α和GM-CSF。
白細(xì)胞介素（ILs)
1．IL-2 為人體最重要、作用最強(qiáng)的T細(xì)胞生長因子，能提高T細(xì)胞數(shù)量和活性以增強(qiáng)宿主的免疫功能，同時誘導(dǎo)增強(qiáng)NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞和CTL效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化和多種細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-2的抗病毒效應(yīng)是由IFN-γ介導(dǎo)的，即通過對NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞的激活與趨化作用，誘導(dǎo)這些細(xì)胞釋放IFN-γ等細(xì)胞因子，起到抗病毒作用。
研究發(fā)現(xiàn)，用IL-2每周2次肌注治療慢性乙型肝炎，12周后，57%患者HBVDNA載量降低50%以上，但對HBeAg消除不滿意。慢性丙型肝炎對IL-2的治療應(yīng)答反應(yīng)優(yōu)于乙型肝炎，初步結(jié)果顯示，部分病例ALT恢復(fù)正常，血清HCV RNA轉(zhuǎn)陰。
2．IL-12 是由巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的一種異源二聚體細(xì)胞因子，主要生物學(xué)活性有：增強(qiáng)NK/LAK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性；促進(jìn)特異性CTL細(xì)胞應(yīng)答；促進(jìn)活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖；誘導(dǎo)靜止及活化的T細(xì)胞及NK細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌IFN-γ，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用；尤其是具有調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞之間的平衡。IL-12不僅對細(xì)胞免疫發(fā)揮作用，而且直接影響體液免疫，有顯著的免疫保護(hù)作用。
IL-12可通過增強(qiáng)病毒感染后的特異性和非特異性免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗病毒作用，對于多種類型病毒的復(fù)制和表達(dá)都具有抑制作用。受IL-12刺激的NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞清除受病毒感染細(xì)胞的第一步是識別，這涉及MHC限制性的識別過程，而IL-12可以增強(qiáng)受感染細(xì)胞中MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達(dá)。體外IL-12的抗病毒活性能被抗IFN-γ的單克隆抗體中和，但不能被抗IL-12單克隆抗體所拮抗，說明IL-12的抗病毒作用很大程度上依賴于IFN-γ的誘生。IL-12對HSV、HIV、肝炎病毒感染有良好的治療作用，國外用IL-12治療AIDS、慢性丙型病毒性肝炎已進(jìn)入臨床Ⅰ/Ⅱ期階段。
腫瘤壞死因子（TNF) 是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，前者產(chǎn)生TNF-α，后者產(chǎn)生TNF-β。此外，B細(xì)胞、NK細(xì)胞等受刺激也能表達(dá)TNF-α或TNF-β，許多病毒能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生TNF。研究表明，TNF能激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)CTL識別受病毒感染細(xì)胞的能力及調(diào)節(jié)MHC分子表達(dá)，有選擇性地破壞受感染細(xì)胞，從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上有效地抑制病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。值得注意的是，近年研究發(fā)現(xiàn)TNF能增加某些逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制。因此，TNF的作用復(fù)雜，具多樣性。
粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子（GM-CSF) GM-CSF來源于激活的T細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞等，能促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖成熟，增強(qiáng)依賴抗體的細(xì)胞毒活性、細(xì)胞表面受體抗原表達(dá)，并刺激細(xì)胞因子的分泌，尤其是IFN-α等抗病毒細(xì)胞因子的釋放。
GM-CSF在乙型肝炎的治療和預(yù)防中具有十分重要的作用。應(yīng)用IFN治療出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)減少的慢性乙型肝炎患者，改用GM-CSF和IFN聯(lián)合療法，結(jié)果使HBVDNA水平顯著降低，甚至轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)氨酶和組織學(xué)活性指數(shù)也顯著降低。國內(nèi)外臨床研究表明，GM-CSF可抑制HBV DNA水平，增強(qiáng)機(jī)體抗HBV能力，與IFN聯(lián)用可更有效地清除HBV。
（一)以疫苗為基礎(chǔ)的免疫治療
多肽疫苗法 是指接種由明確抗原組成的最小結(jié)構(gòu)，激發(fā)有效的特異性免疫應(yīng)答，并避免可能的危害作用。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-A2陽性者HBcAg特異性CTL最佳識別位點(diǎn)在HBcAg18～27aa，因此提出用該肽作為合成肽疫苗進(jìn)行免疫治療以終止病毒感染的設(shè)想。動物實(shí)驗(yàn)表明，合成肽結(jié)合某些佐劑或脂質(zhì)體，能有效地誘導(dǎo)出CTL反應(yīng)。在正常人體內(nèi)進(jìn)行治療性HBV疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，獲得了該疫苗的有效劑量值范圍，同時觀察到注射4次后誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)持續(xù)超過9個月，并證實(shí)Th細(xì)胞活性在其中的重要作用。新近研究認(rèn)為有必要聯(lián)合非特異誘導(dǎo)劑如IL-12、IFN-γ，以調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞的平衡，可在CTL水平打破其免疫耐受狀態(tài)。
核酸疫苗法 即直接注射DNA或RNA，這是一種簡單而有效的治療方法，原理是利用病毒不同的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物可誘發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，同時誘導(dǎo)多個表位的CTL反應(yīng)，可能對治療某些因基因突變而產(chǎn)生免疫逃避的病毒感染性疾病起重要作用（參見第13章)。
重組蛋白顆粒法 可溶性蛋白抗原免疫通常誘發(fā)CD4＋細(xì)胞而非CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)。研究證實(shí)，通過不同途徑注射重組裸S抗原顆粒，可在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出MHCⅠ類分子限制性S蛋白特異性CD8＋CTL應(yīng)答。S抗原顆粒需要經(jīng)過一種新型的內(nèi)體加工途徑才能發(fā)揮作用。在外源性蛋白抗原加工過程中，樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及外源性β2微球蛋白起重要作用。
（二)以抗原遞呈為基礎(chǔ)的免疫治療
抗原提呈細(xì)胞（APC)是宿主免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)，能否進(jìn)行有效的抗原遞呈直接關(guān)系到免疫激活或免疫耐受的誘導(dǎo)。而樹突狀細(xì)胞（DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APC，也是唯一能激活初始型T細(xì)胞的APC，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特地位，成熟后高表達(dá)MHCⅠ、Ⅱ類分子，同時提供充分的協(xié)同刺激信號，在與T細(xì)胞結(jié)合后強(qiáng)烈激活T細(xì)胞，分泌高水平IL-2，主導(dǎo)Th1型應(yīng)答。DC用于腫瘤免疫治療，能顯著誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗原特異性CTL。利用DC作為免疫佐劑，刺激宿主產(chǎn)生大量的特異性CTL，可為抗病毒治療開辟新的途徑。
DC用于病毒的免疫治療主要是通過體外用病毒抗原攻擊致敏DC，再回輸體內(nèi)，誘導(dǎo)出病毒抗原特異性的CTL，殺傷病毒感染的細(xì)胞。用抗原致敏DC的方法有：通過病毒抗原多肽或蛋白直接沖擊DC；用滅活的病毒疫苗共同孵育或活病毒感染；用陽離子脂質(zhì)體攜帶病毒蛋白或合成的雙鏈RNA沖擊等。有學(xué)者用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫耐受模型進(jìn)行了DC打破HBsAg耐受性的研究，用含HBsAgDNA疫苗只能在一部分小鼠刺激抗體反應(yīng)，但無特異性CTL反應(yīng)出現(xiàn)；而用IL-4、GM-CSF活化骨髓來源的DC在所有小鼠均能刺激脾細(xì)胞CTL反應(yīng)，并且活化的轉(zhuǎn)基因DC不需在體外用HBsAg沖擊，就能將S抗原內(nèi)在化并提呈于CTL前體細(xì)胞，提示用細(xì)胞因子活化的DC進(jìn)行抗原遞呈能夠打破免疫耐受狀態(tài)，引發(fā)抗病毒CTL反應(yīng)。
（王傳恩 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院)
