這4種毒素的氨基酸序列已經(jīng)確定，但功能區(qū)分布仍不清楚。巰基活化毒素肽鏈C端都有一個非常保守的12肽段，其內(nèi)有1個Cys（圖3-5)。由于只有1個Cys，毒素沒有肽鏈內(nèi)二硫鍵；毒素聚合時這個Cys既不與鄰近毒素的Cys連接，也不與其它毒素或靶細(xì)胞膜蛋白連接，所以Cys上有1個游離“-SH（巰基)”。

圖3-5  巰基活化溶細(xì)胞毒素C端的高度保守12肽段

毒素C端可能是R區(qū)，并起著穩(wěn)定肽鏈空間構(gòu)象的重要作用，其中12肽段很可能就是結(jié)合部位。而肽鏈中段大約每3～4aa就交替顯示親水性或疏水性，其中大約30aa形成的兩性α螺旋結(jié)構(gòu)，是襯在聚合體跨膜孔親水性內(nèi)腔的，表明中段是毒素的T區(qū)。

RTX家族  如大腸埃希菌溶血素A（hemolysin，HlyA)。RTX（repeat-in-toxin)家族是許多革蘭陰性菌產(chǎn)生的一類獨特的單肽鏈毒素，其共同特點是：①肽鏈C端有若干個保守的“富含甘氨酸和天冬氨酸九肽重復(fù)序列”（GD-rich nonapeptide sequence)，故命名為“RTX”；②需要一種翻譯后成熟機制，即通過共價酰胺鍵將脂肪酸連接至肽鏈內(nèi)賴氨酸殘基上才能激活。

大腸埃希菌首先合成的是無活性的溶血素A前體（pro-HlyA)，其N端有1個高度保守區(qū)段，即跨膜區(qū)，由4個強兩性α螺旋構(gòu)成，可以插入細(xì)胞膜形成跨膜孔；中段為活化區(qū)，含2個獨立的�；�轉(zhuǎn)移酶識別區(qū)，每個區(qū)內(nèi)各有1個賴氨酸酰化靶位（K1和K2)；C端為GD九肽重復(fù)序列區(qū)，可識別并結(jié)合靶細(xì)胞膜受體（圖3-6)。

大腸埃希菌溶血素C（HlyC)可利用肉豆蔻酰-酰基載體蛋白，給pro-HlyA的K⁵⁶⁴和K⁶⁹⁰以共價酰胺鍵各連接1個肉豆蔻酸分子，使HlyA獲得最大溶血活性。成熟的HlyA分泌出菌體后，必須與Ca²⁺結(jié)合后才能和受體結(jié)合。RTX的C端一般有8～18個GD九肽重復(fù)序列拷貝，每個重復(fù)序列可結(jié)合1個Ca²⁺，然后形成短β-片層，構(gòu)成“彈簧”樣的β環(huán)。β環(huán)本身不能插入靶細(xì)胞膜，但它們能促成毒素不可逆地插進膜內(nèi)。

圖3-6  RTX毒素分子結(jié)構(gòu)示意圖

百日咳桿菌腺苷化酶毒素（adenylatecyclase toxin，CyaA)與其它RTX不同（圖3-6)，主要表現(xiàn)在：①CyaA的N端多了1個腺苷環(huán)化酶活性區(qū)；②在酶活性區(qū)末開始的一段肽鏈中，含有14個“丙氨酸重復(fù)序列”（ASAAAGAVAAAXG)，參與構(gòu)成跨膜區(qū)，可以協(xié)助酶活性區(qū)進入靶細(xì)胞；③C端的GD九肽重復(fù)序列特別多，有38個拷貝；④當(dāng)CyaA在百日咳桿菌細(xì)胞漿內(nèi)合成時，一般由棕櫚酸�；疜⁹⁸³即可激活；當(dāng)CyaA在大腸埃希菌中表達時，則需K⁸⁶⁰和K⁹⁸³均被�；�后才被活化。

三、多肽毒素

大腸埃希菌耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST)肽鏈一般只有15～50aa，其中一大半是保守序列。保守區(qū)具有毒素的完全毒性，其內(nèi)有6個Cys，形成3個二硫鍵，構(gòu)成一個有3個β-轉(zhuǎn)角的右手螺旋結(jié)構(gòu)，其第二轉(zhuǎn)角區(qū)內(nèi)的“CNPAC”極端保守，可能是受體結(jié)合部位，對毒素活性影響最大。

第三節(jié)  細(xì)菌毒素的作用機制

細(xì)菌毒素一般至少有二個功能區(qū)，一是靶細(xì)胞膜受體結(jié)合區(qū)，決定毒素對靶細(xì)胞的特異性并介導(dǎo)毒素進入細(xì)胞；另一個是活性區(qū)，它選擇“靶點”，決定毒力強弱和作用機制，具有膜穿孔或酶活性，并引起相應(yīng)臨床癥狀。

細(xì)菌毒素的特定作用對象稱為“靶點”，它可以是某種細(xì)胞、細(xì)胞器、酶或其他大分子物質(zhì)，例如，志賀毒素作用于核糖體60S亞基，霍亂腸毒素作用于G蛋白，膜損傷毒素作用于細(xì)胞膜。毒素要發(fā)揮毒性必須到達靶點，這一過程大致分四步完成：①毒素結(jié)合區(qū)與敏感細(xì)胞的相應(yīng)膜受體結(jié)合；②毒素進入細(xì)胞或毒素信號導(dǎo)入細(xì)胞；③毒素到達靶點；④毒素激活、修飾或改變靶點。

一、毒素進入靶細(xì)胞的一般機制

（一)毒素與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合

細(xì)菌毒素與靶細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合是發(fā)揮毒性作用的第一步。毒素引起宿主何種臨床癥狀，首先取決于細(xì)菌的定植部位及毒素受體。例如，霍亂腸毒素（CT)的受體是神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，而GM1幾乎存在于所有的哺乳動物細(xì)胞膜上，理論上CT應(yīng)可以引起全身各種器官的疾病。但由于自然感染的霍亂弧菌定植局限于小腸粘膜表面，其分泌的CT亦受限制，只能與小腸粘膜上皮細(xì)胞膜的GM1分子結(jié)合，因此僅引起以水樣腹瀉為主的霍亂癥狀。

毒素受體是一類能與相應(yīng)毒素特異結(jié)合，并能介導(dǎo)毒素（或毒素信號)進入細(xì)胞內(nèi)的膜分子，如蛋白質(zhì)、糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿等（表3-1)。受體應(yīng)具有以下特點：①特異性：受體與毒素有特異對應(yīng)性；②高親和性：受體與毒素結(jié)合能力較強，一般是分子空間構(gòu)象互補吻合，具有不可逆性。當(dāng)然，也有低親和性受體；③效應(yīng)性：受體能介導(dǎo)毒素內(nèi)在化，或傳遞毒素信息。

細(xì)菌毒素只有1個受體結(jié)合區(qū)，故1個毒素分子一般只與1個受體分子結(jié)合，但梭菌神經(jīng)毒素（CNTs)比較特別。研究表明，CNT 的H_C-N可與蛋白或糖蛋白分子結(jié)合，若其C端缺失10aa，毒素就不能與脊髓神經(jīng)元結(jié)合；而H_C-C的C端最后34aa發(fā)生變異，毒素亦不能與GD1b或GT1b等膜分子結(jié)合，這提示CNT可能采用雙受體模式與神經(jīng)元結(jié)合。已有動物實驗證實，肉毒毒素B/E在多唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂存在時，均可與突觸體上的synaptotagminⅡ蛋白強力結(jié)合，這提示CNT到達神經(jīng)肌肉接頭后，H_C-C可與神經(jīng)末梢突觸前膜上的GD1b等低親和性結(jié)合，然后H_C-N再與膜蛋白高親和性結(jié)合，介導(dǎo)毒素分子內(nèi)在化進入神經(jīng)元。

毒素與膜受體的特異性結(jié)合具有空間構(gòu)象互補性，如CT-B₅與GM1結(jié)合的微結(jié)構(gòu)是一個疏水性袋狀結(jié)構(gòu)，由一個B鏈分子的Ile⁵⁸和Trp⁸⁸與相鄰B鏈分子的Lys³⁴構(gòu)成，GM1糖鏈上最末一個半乳糖直接錨合在這個疏水性“口袋”內(nèi)，這種空間構(gòu)象的吻合使CT不可逆地結(jié)合在靶細(xì)胞膜表面（圖3-12)。

（二)細(xì)菌毒素的入胞及轉(zhuǎn)運機制

入胞方式  細(xì)菌毒素與膜受體特異結(jié)合后，可通過以下方式進入細(xì)胞（圖3-1)：

1．穿膜進入  在電鏡下觀察到，一些有明顯三功能區(qū)的毒素，如DT、TeNT等，在低pH條件下，毒素R區(qū)與膜受體結(jié)合后，其T區(qū)可在脂質(zhì)雙層膜上形成所謂“毒素離子通道”，足以使未折迭的C區(qū)經(jīng)通道穿膜進入細(xì)胞內(nèi)。

2．越膜控制  具有越膜控制方式的毒素與膜受體結(jié)合后，不進入細(xì)胞，而是通過受體分子構(gòu)型的改變，引起細(xì)胞表面調(diào)節(jié)裝置改變或激活膜內(nèi)鑲嵌的酶分子，將毒素攜帶的生物信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)代謝反應(yīng)。如大腸埃希菌耐熱腸毒素（ST)的受體可能是鳥苷環(huán)化酶C，ST一旦與之結(jié)合則激活此酶，導(dǎo)致靶細(xì)胞合成cGMP。

3．內(nèi)在化（internalization)  是指細(xì)菌毒素與相應(yīng)受體結(jié)合后，依靠受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（receptor mediated endocytosis，RME)進入細(xì)胞。幾乎所有的真核細(xì)胞膜上都有一種特殊的“內(nèi)吞細(xì)胞器”，稱為膜小泡（coated vesicles)或籠型蛋白（clathrin)，其功能與細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)。

毒素的REM過程  細(xì)菌毒素依靠RME進入細(xì)胞的過程比較復(fù)雜（圖3-1)。

1．白喉毒素  B鏈與靶細(xì)胞膜受體pro-hHB-EGF的微結(jié)構(gòu)（由Phe¹¹⁵、Leu¹²⁷和Glu¹⁴¹構(gòu)成)結(jié)合后，多個DT分子聚集成寡聚體，再被內(nèi)吞進入內(nèi)體（endosome)。一般情況下，含有異物的內(nèi)體將被酸化，內(nèi)體內(nèi)的酸性環(huán)境（pH5.2～5.8)使DT的B鏈發(fā)生構(gòu)象改變而暴露跨膜區(qū)（T)區(qū)，于是B鏈聚合體的α8/9螺旋結(jié)構(gòu)插入內(nèi)體膜內(nèi)，α1也隨后插入，形成跨膜通道，使A鏈穿過內(nèi)體膜，連接A-B的二硫鍵突出于細(xì)胞質(zhì)中，被酶水解，A鏈得以進入宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖3-7)。

圖3-7  白喉毒素穿過內(nèi)體進入細(xì)胞質(zhì)示意圖

2．霍亂腸毒素   B鏈與小腸粘膜上皮細(xì)胞膜神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體結(jié)合后，GM1在膜上橫向移位，使CT-GM1復(fù)合體簇集在膜的小凹內(nèi)，然后質(zhì)膜收縮內(nèi)陷，內(nèi)在化形成一個膜小泡或內(nèi)體。膜小泡通過膜小泡通道轉(zhuǎn)運進入高爾基體，最終到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，CT-A與B₅解離，依靠A2錨接在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有二硫鍵異構(gòu)酶，可催化A1與A2解離，A1穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的作用靶位（圖3-8)。

圖3-8  霍亂腸毒素進入細(xì)胞質(zhì)示意圖

3．炭疽毒素  炭疽毒素的保護性抗原PA83（83kDa)通過C端與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合，隨后被宿主細(xì)胞蛋白酶在其N端¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷位點處水解，切去1個20kDa的片段（PA20)，保留63kDa肽鏈（PA63)，并暴露與致死因子（LF)和水腫因子（EF)高親和性結(jié)合的位點，可以與1條LF或EF肽鏈結(jié)合。7分子PA63聚合形成中空的環(huán)形七聚體前期小孔（prepore)，與LF或EF結(jié)合后，經(jīng)RME過程進入內(nèi)體。在內(nèi)體的酸性環(huán)境中，PA63構(gòu)象改變，插入內(nèi)體膜中，形成內(nèi)徑為2nm的跨膜離子通道，將連接在七聚體上的7分子LF或EF轉(zhuǎn)遞入胞漿內(nèi)（圖3-9)。

圖3-9  炭疽毒素入胞方式和作用機制

4．破傷風(fēng)痙攣毒素與肉毒毒素  破傷風(fēng)痙攣毒素（TeNT)與肉毒毒素（BoNTs)的結(jié)構(gòu)、受體及酶活性機制非常相似，但臨床癥狀卻大不相同。TeNT主要通過阻止脊髓前角抑制性中間神經(jīng)元釋放抑制性神經(jīng)介質(zhì)（甘氨酸和γ氨基丁酸)，使運動神經(jīng)元持續(xù)興奮而導(dǎo)致骨骼肌痙攣(圖3-10)；而BoNTs主要通過阻止膽堿能末梢神經(jīng)元釋放乙酰膽堿，阻斷神經(jīng)沖動傳遞，引起神經(jīng)肌肉弛緩性麻痹。

圖3-10 破傷風(fēng)梭菌痙攣毒素作用機制

研究表明，TeNT與BoNTs在入胞和轉(zhuǎn)運時存在微妙的差異，表現(xiàn)在：①BoNTs結(jié)合部位在突觸前神經(jīng)末梢膜，而TeNT結(jié)合在突觸前神經(jīng)末梢終扣；②TeNT與BoNTs內(nèi)在化進入神經(jīng)肌肉接頭后，進入不同的膜小泡。BoNTs進入酸性的內(nèi)體，TeNT則進入神經(jīng)元突觸前囊的突觸小泡（synaptic vesicles，SVs)內(nèi)。因此，這二種毒素的作用靶點不同。

在內(nèi)體的酸性環(huán)境中，BoNTs構(gòu)象改變，暴露疏水性跨膜區(qū)，在內(nèi)體膜上形成穿膜孔，釋放L鏈進入神經(jīng)元胞漿內(nèi)，使BoNTs停留在外周神經(jīng)肌肉接頭處中，封閉神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。而TeNT通過重鏈H_C識別神經(jīng)肌肉結(jié)頭處運動神經(jīng)元外胞漿膜上的受體并與之結(jié)合，促使毒素進入細(xì)胞內(nèi)由細(xì)胞膜形成的突觸小泡（SVs)中。進入SVs后，由于SVs可利用生理性再循環(huán)運輸神經(jīng)介質(zhì)等多種物質(zhì)，因而可能利用SVs逆向運送TeNT。研究發(fā)現(xiàn)，在正在生長的海馬神經(jīng)元軸索中，存在自發(fā)再循環(huán)的攜帶金粒標(biāo)記TeNT的SVs，這提示SVs可能通過交替胞飲（pinocytosis)和胞吐（exocytosis)的再循環(huán)，逐m.gydjdsj.org.cn/yishi/級接力式轉(zhuǎn)遞，從外周神經(jīng)末梢沿神經(jīng)軸索逆行向上，將TeNT運送至脊髓前角抑制性中間神經(jīng)元。在此處SVs與內(nèi)體融合，通過跨膜區(qū)的穿膜孔作用，釋放L鏈進入神經(jīng)元胞漿內(nèi)。

二、溶細(xì)胞機制

（一)聚合型穿孔毒素

這類毒素至少存在二種聚合方式：①單體分子在靶細(xì)胞膜外側(cè)面上或在液相中形成聚合體（如α-Hly形成七聚體)，之后插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶解；②一個單體分子先行插入細(xì)胞膜內(nèi)，隨后若干個單體分子緊挨先插入的毒素分子依此插入，排列成中空的跨膜聚合體，導(dǎo)致細(xì)胞溶解（圖3-1)。例如，鏈球菌溶素O用數(shù)十乃至100多個單體分子聚合形成超大結(jié)構(gòu)孔。這些毒素的聚合體異乎尋常的穩(wěn)定，一般很難解聚。

金黃色葡萄球菌α-溶素  α-Hly單體分子可與人紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞及家兔紅細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，結(jié)合方式有：與膜受體神經(jīng)節(jié)苷脂親和性的特異結(jié)合，或與膜脂低親和性的非特異結(jié)合。結(jié)合后，單體分子在膜外聚合成七聚體分子后，再插入細(xì)胞膜內(nèi)。

七聚體空間構(gòu)象呈“蘑菇”形，由帽、莖干和7個輪緣組成（圖3-10，圖3-4)。帽呈七邊形，直徑10nm，高7nm，與膜脂質(zhì)層平行。輪緣在帽下緣，向下凸出，在輪緣和莖干頂部之間有一裂縫，此處有一個堿性和芳香氨基酸富含區(qū)，可以和膜磷脂頭部或其它膜受體互相作用。

7個單體分子的莖干區(qū)在裝配時，聚合形成一個高5.2nm的疏水性中空桶形結(jié)構(gòu)（莖干)，與氨基酸門閂區(qū)及三明治區(qū)的內(nèi)面共同形成聚合體的核心，然后莖干插入靶細(xì)胞膜，形成跨膜通道。通道高約10nm，孔徑1.4～4.6nm，由于孔徑小，只允許離子、水和小分子物質(zhì)通過，但離子外泄破壞了細(xì)胞滲透壓的平衡，可導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡。

圖3-10 α-Hly七聚體結(jié)構(gòu)圖  (左)正視圖  (右)俯視圖

巰基活化溶細(xì)胞毒素家族  鏈球菌溶素O首先是1個（或極少幾個)單體分子與膜膽固醇分子結(jié)合后插入膜內(nèi)，然后其它單體分子以此為基點依次插入膜內(nèi)，排列成弓形。弓形聚合物形成后，可能在其相對的游離邊發(fā)生“切割”，細(xì)胞膜上出現(xiàn)弓形損傷，最終導(dǎo)致規(guī)則或不規(guī)則的環(huán)形損傷。

在電鏡下，可見細(xì)胞膜上出現(xiàn)1個由許多（70～125個)單體分子聚合形成的冠狀雙層大孔徑跨膜孔，外層環(huán)的單體分子疏水面朝外，內(nèi)層環(huán)的單體分子親水面朝內(nèi)�？缒た鬃畲笸鈴娇蛇_34nm，內(nèi)徑≥24nm，比α-Hly七聚體和補體攻膜復(fù)合體的跨膜孔都大，甚至允許蛋白質(zhì)等大分子輕易外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解。

巰基活化毒素有兩個突出特點：①膜受體是膽固醇；②毒素對O₂敏感。在有游離膽固醇分子或氧存在時，毒素可失去溶血活性；若消除這兩個因素，又重新恢復(fù)活性。以往對這一現(xiàn)象的解釋是，巰基活化毒素帶有一個Cys-SH，而-SH（巰基)正好對氧化作用敏感，因此，毒素的溶血性與巰基的氧化或還原有關(guān)，即在有氧狀態(tài)下Cys-SH被氧化則毒素失活，在含巰基還原劑存在時被還原則毒素恢復(fù)活性。但是，近年發(fā)現(xiàn)，巰基活化毒素的溶血性與巰基的氧化或還原無關(guān)，原因不清。

（二)RTX家族

RTX可分為二類：①低特異性RTX，靶細(xì)胞范圍廣泛。如大腸埃希菌溶血素A（HlyA)幾乎可以溶解各種哺乳動物細(xì)胞（如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)；②高特異性RTX，靶細(xì)胞范圍很窄，如放線共生放線桿菌溶血素A只溶解人和靈長類動物白細(xì)胞。

RTX可通過單分子機制形成跨膜孔，一般地，1～3個HlyA分子即可成孔，即使有寡聚化作用，也是插入膜內(nèi)后單體分子附加上去的。HlyA通過靜電電荷與細(xì)胞膜可逆吸附，接著C端結(jié)合區(qū)與靶細(xì)胞膜上的整合素受體不可逆結(jié)合，最后N端疏水螺旋結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜，形成跨膜通道，跨膜孔直徑約為1nm，允許細(xì)胞外的Ca^2＋流入和細(xì)胞內(nèi)的K^＋流出，從而改變細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。

RTX以亞溶細(xì)胞濃度作用于靶細(xì)胞時，不會立即溶解細(xì)胞，但可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如HlyA與靶細(xì)胞膜結(jié)合后，可導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排及G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，合成細(xì)胞因子（如IL-1和TNF)，釋放生物活性介質(zhì)（如白三烯B4)，使膜CD14分子大量脫落，脫落的CD14分子粘附在鄰近的細(xì)胞膜上，使這些細(xì)胞對LPS更加敏感。

三、酶活性機制

許多細(xì)菌毒素，如霍亂腸毒素、白喉毒素、肉毒毒素、百日咳毒素、志賀毒素、炭疽毒素等具有酶活性，主要包括：

（一)ADPR轉(zhuǎn)移酶

腺苷二磷酸核糖（ADPR)轉(zhuǎn)移酶（ADP-ribose transferase)的A鏈一般具有二種酶活性，即尼克酰胺腺苷二磷酸（NAD)糖基水解酶和ADPR轉(zhuǎn)移酶，前者將NAD水解為ADPR和尼克酰胺，后者則將ADPR轉(zhuǎn)移到一個受體分子上去(圖3-12)。NAD糖基水解酶作用機制大體相同，故毒素的毒性效應(yīng)取決于ADPR轉(zhuǎn)移酶所選擇的ADPR受體。

霍亂腸毒素  細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)有腺苷環(huán)化酶（adenylatecyclase，ACase)，可催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。ACase的活性受與其偶聯(lián)的誘導(dǎo)性G蛋白（Gs)或抑制性G蛋白（Gi)調(diào)控（圖3-12)。G蛋白由α/β/γ3個亞基組成，處于靜止?fàn)顟B(tài)時，α/β/γ聚合在一起并與GDP結(jié)合。當(dāng)誘導(dǎo)劑與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，G蛋白立即與GTP結(jié)合而被激活，其α與β/γ2個亞基分離。Gsα亞基與ACase結(jié)合并使之活化；若Gi被激活，Giα與ACase結(jié)合，ACase活性受抑制。Gsα處于活化狀態(tài)時，其自身的GTP水解酶活性也被激活，可緩慢催化GTP水解為GDP，逐漸使本身失活，重新與β/γ兩亞基聚合，G蛋白恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，ACase停止合成cAMP。

圖3-12  CT、DT和PT催化的ADP核糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)

CT-A1具有NAD糖基水解酶活性（ADPR的受體是水分子)：

  CT-A1

NAD ＋ HOH ADPR^－ ＋ 尼克酰胺 ＋H⁺ （反應(yīng)一)

CT-A1亦具精氨酸特異性ADPR轉(zhuǎn)移酶活性，主要選擇細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)誘導(dǎo)性G蛋白的α亞基（Gsα)作為ADPR受體，將ADPR轉(zhuǎn)移到Gsα-Arg¹⁷⁴上，從而激活Gs蛋白：

 CT-A1

ADPR^－ ＋ Gsα-Arg¹⁷⁴ADPR-Arg¹⁷⁴-Gsα （反應(yīng)二)

細(xì)胞內(nèi)有一些膜蛋白和細(xì)胞因子，如ADP核糖化因子（ADP-ribosylation factor，ARF)能促進或放大CT-A1的酶活性。目前至少已發(fā)現(xiàn)6種ARF，為單肽鏈蛋白，定位在細(xì)胞膜或高爾基體上。ARF與GTP結(jié)合后可促進CT-A1對Gsα的ADP核糖基化活性。

霍亂弧菌定居在人的小腸粘膜表面，所分泌的CT可與小腸腸腔上皮細(xì)胞微絨毛的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1分子結(jié)合，進入小腸粘膜上皮細(xì)胞后，ARF-GTP促進CT-A1水解NAD，將ADPR轉(zhuǎn)移給Gsα。Gsα結(jié)合ADPR后被激活，同時又因結(jié)合了GTP，降低了本身的GTP酶活性，所以保持持續(xù)活化狀態(tài)，一直與ACase結(jié)合，致使ACase持續(xù)性活化，合成大量的cAMP（圖3-13)。

圖3-13  霍亂毒素作用機制示意圖

cAMP作為第二信使可激活細(xì)胞的許多生理功能，其中大多數(shù)生理功能是通過激活腺苷酸蛋白激酶A（APK)等，由后者促使多種靶蛋白磷酸化來表現(xiàn)的，可能機制之一是：小腸粘膜細(xì)胞內(nèi)過量的cAMP過度激活A(yù)PK，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)Na^＋轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白分子磷酸化，使鈉泵活性下降，小腸粘膜細(xì)胞Na^＋吸收受阻，Cl^－外流和液體分泌增加，腸腔內(nèi)水潴留而引起嚴(yán)重腹瀉（圖3-12)。

白喉毒素  DT-A水解NAD后，選擇肽鏈延長因子-2（elongationfactor 2，EF-2)為ADPR受體。EF-2分子上有一個少見的“2-[3-羧基酰胺-3-（三甲胺基)丙基]組氨酸”，即白喉酰胺（diphthamide，DA)，DT-A把ADPR轉(zhuǎn)移給DA。EF-2是肽鏈合成轉(zhuǎn)位反應(yīng)所必需的酶，它與ADPR結(jié)合后失去活性，核糖體“受位”上正在合成的肽鏈因而不能轉(zhuǎn)位至核糖體“給位”，使氨基酰-tRNA無法與核糖體結(jié)合，肽鏈延伸反應(yīng)停止，靶細(xì)胞因不能合成蛋白質(zhì)而死亡。

肉毒毒素  BoNT-C3也是ADPR轉(zhuǎn)移酶，但它選擇的ADPR受體是Rho蛋白。Rho蛋白屬于小分子GTP酶中的Ras超家族，其主要成員有Rho-A/B/C、Rac-1/-2、Ras和Cdc42蛋白等。BoNT-C3水解NAD后專一地將ADPR轉(zhuǎn)移給Rho-Asn⁴¹，使Rho蛋白失去自身的GTP酶活性，其GTP酶活性也不能被GTP酶活化蛋白（GTPaseactivating proteins，GAP)所激活，因此，Rho蛋白不能水解GTP為GDP，一直保持與GTP結(jié)合的持續(xù)活化狀態(tài)。

在細(xì)胞內(nèi)，Rho蛋白起著分子開關(guān)的作用，它們的持續(xù)性活化可激活Rho蛋白激酶家族的一系列酶分子，引起肌動蛋白細(xì)胞骨架解聚、改組或損傷，以及細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇水平改變，進而影響許多細(xì)胞功能，如細(xì)胞形態(tài)、運動性、生長周期的進程、細(xì)胞胞飲或胞吐等，最終可導(dǎo)致細(xì)胞病變或壞死。

BoNT-C2不同于BoNT-C3，水解NAD后直接將ADPR轉(zhuǎn)移給受Rho蛋白影響的G-(β/γ)-肌動蛋白-Arg¹⁷⁷（不是G-α-肌動蛋白)，影響肌動蛋白的聚合及細(xì)胞骨架的構(gòu)架。

綜上所述，ADPR轉(zhuǎn)移酶毒素的NAD糖基水解酶活性基本相同，但選擇的ADPR受體可以不同，因此，ADPR轉(zhuǎn)移毒素具有多種多樣的毒性效應(yīng)。迄今至少已發(fā)現(xiàn)4類ADPR的受體：G蛋白、EF-2、Rho蛋白和肌動蛋白（表3-2)。

表3-2  細(xì)菌毒素的基團轉(zhuǎn)移酶活性

（二)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl-transferase)

大梭菌細(xì)胞毒素家族（LCTs)作用的靶點也是Rho蛋白，但底物不是NAD。TcdA、TcdB和TcsL可利用尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc)為底物，水解UDP-Glc后，將葡萄糖基特異性地轉(zhuǎn)移給Rho-Thr等。Tcnα則利用尿苷二磷酸氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)為底物，將UDP- GlcNAc水解后，將氨基葡萄糖基特異性地轉(zhuǎn)移給Rho-Thr等（表3-2)。Rho蛋白糖基化后，一直保持與GTP結(jié)合的持續(xù)活化狀態(tài)，最終導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架改組或損傷等。

（三)脫嘌呤酶（depurinase)

志賀毒素（ST)和志賀樣毒素（SLT)具有相同的RNA-N-糖苷酶活性，底物是真核細(xì)胞核糖體60S亞基的28SrRNA，可水解28S rRNA 5＇端4 324位腺嘌呤的N-糖苷鍵，該腺嘌呤脫落使60S亞基失活，依賴EF-1的氨基�；痶RNA不能與其結(jié)合，致使蛋白質(zhì)合成停止，靶細(xì)胞死亡。

（四)脫酰胺酶（deamidase)

大腸埃希菌可以產(chǎn)生一種作用于Rho蛋白的毒素，即細(xì)胞毒性壞死因子（cytotoxicnecrotizing factors，CNFs)。當(dāng)在Vero細(xì)胞培養(yǎng)液中加入CNF1后，CNF1進入細(xì)胞，表現(xiàn)出脫酰胺酶活性，專一地將Rho-Gln⁶³脫酰胺變成Rho-Glu⁶³，Rho蛋白因而失去GTP酶活性，保持其持續(xù)活化狀態(tài)，導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架改組、肌動蛋白應(yīng)激纖維聚集和細(xì)胞壞死等多種生理和病理現(xiàn)象。

（五)鋅內(nèi)肽酶（zine endopeptidase)

梭菌神經(jīng)毒素  靶分子是神經(jīng)元膜內(nèi)的小突觸泡蛋白（synaptobrevin)。毒素可切割、降解儲存有神經(jīng)介質(zhì)的小突觸泡蛋白特異性肽鍵，使小泡膜蛋白發(fā)生改變，從而阻止神經(jīng)介質(zhì)的釋放。

1．神經(jīng)胞吐過程  在N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF)調(diào)控下，可溶性NSF附著蛋白(soluble NSF-attachm醫(yī)學(xué)考研網(wǎng)ent protein，SNAP)與一組保守的“SNAP受體”（SNAPreceptors，SNAREs)的聚合及解聚在神經(jīng)胞吐過程中起著關(guān)鍵作用。SNAREs主要成員有：

（1)小突觸泡蛋白：又稱為小泡相關(guān)性膜蛋白（vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)，位于突觸小泡（SV)膜上。如人和大鼠的VAMP2，其C端穿膜進入SVs泡內(nèi)，N端暴露于SV外的神經(jīng)元胞漿內(nèi)。

（2)銜接素（syntaxin，SYN)：位于突觸前膜上，如大鼠SYN1A，其C端插入突觸前膜內(nèi)，N端游離于神經(jīng)元胞漿內(nèi)。

（3)突觸小體相關(guān)蛋白（synaptosomal-associatedprotein，SNAP-25)：它沒有跨膜區(qū)，在肽鏈中部有4個Cys，Cys被棕櫚酸�；�后，依靠棕櫚酸分子錨在突觸前膜的脂類分子上。

當(dāng)神經(jīng)元受刺激后，其突觸前囊內(nèi)的SVs向突觸前膜移動，隨后VAMP2中段的α-螺旋與SYN1近膜端的α-螺旋和SNAP-25B的N端及C端各一個α-螺旋緊緊纏繞結(jié)合，形成一種卷曲線圈結(jié)構(gòu)（coiled-coil structure)，稱為“核心復(fù)合體”（corecomplexs)，然后與SNAP形成一個高度穩(wěn)定的20S四聚體。由于螺旋狀核心復(fù)合體的“拉緊”作用，促使SVs與突觸前膜對接并融合，融合后即可發(fā)生Ca^2＋調(diào)節(jié)的胞吐作用，SVs將泡內(nèi)的神經(jīng)介質(zhì)釋放進入突觸裂中。最后NSF與四聚體中的SNAP結(jié)合。NSF是一種ATP酶，它可催化四聚體解聚，使SVs與突觸前膜解離進入下一輪再循環(huán)（圖3-14)。

2．梭菌神經(jīng)毒素的酶活性  梭菌神經(jīng)毒素（CNTs)是鋅內(nèi)肽酶，底物是SNAREs，每一種毒素（除BoNT-C1外)只水解1種SNAREs肽鏈上的1個肽鍵。CNTs在人或大鼠SNAREs肽鏈上的酶切位點已基本清楚，均在形成核心復(fù)合體的保守α-螺旋肽段內(nèi)，如VAMP2的α-螺旋肽段內(nèi)有4個CNTs的酶切位點（圖3-15)。

大量的實驗證據(jù)表明，CNTs水解任何一種SNAREs肽鏈，核心復(fù)合體便不能形成，從而阻止SVs與突觸前膜融合及SVs釋放神經(jīng)介質(zhì)，即阻止神經(jīng)傳導(dǎo)。

炭疽毒素  有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是哺乳動物細(xì)胞在進化上古老而保守的細(xì)胞內(nèi)信號途徑，該途徑主要參與調(diào)控胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞形態(tài)等，是細(xì)胞成熟促進因子(如細(xì)胞周期蛋白B/p34^cdc2激酶)活化及細(xì)胞繼續(xù)減數(shù)分裂的必經(jīng)途徑。MAPKs途徑由MAPK激酶1和2（MAPKkinase 1&2，MAPKK1&2)激活，MAPKK1&2是參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)和增殖的關(guān)鍵分子，而其N末端在調(diào)控MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中尤為重要。

炭疽毒素致死因子（LF)可抑制MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。LF（776aa)N端與PA63結(jié)合后，經(jīng)RME進入靶細(xì)胞漿內(nèi)，其C端有1個Zn^2＋結(jié)合位點，具有鋅內(nèi)肽酶活性，其底物是MAPKK1&2，酶切位點是MAPKK1-N端⁷P-I⁸和MAPKK2-N端⁹P-I¹⁰。LF進入靶細(xì)胞內(nèi)后，可切除MAPKK1-N端7aa和MAPKK2-N端9aa，從而阻止MAPKK1/2與它的底物MAPKs相連接，使MAPKs途徑不能活化。因此，LF的毒性主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)靶細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、阻止靜止細(xì)胞進入S期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖3-9)。

（六)腺苷環(huán)化酶（adenylate cyclase)

炭疽毒素水腫因子（EF)肽鏈N末端與PA63結(jié)合并經(jīng)RME進入靶細(xì)胞漿內(nèi)后，其C端具有鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性腺苷環(huán)化酶活性，可在細(xì)胞內(nèi)直接催化合成第二信使cAMP，擾亂細(xì)胞調(diào)控機制，引起一系列細(xì)胞毒效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖3-9)。

百日咳桿菌CyaA溶血活性很弱。CyaA與靶細(xì)胞膜受體結(jié)合后，跨膜區(qū)插入細(xì)胞膜，將酶活性區(qū)轉(zhuǎn)膜進入細(xì)胞內(nèi)。酶活性區(qū)具有依賴Ca^2＋的腺苷環(huán)化酶活性，可在細(xì)胞內(nèi)直接催化合成cAMP，引起一系列細(xì)胞毒效應(yīng)，最終使細(xì)胞死亡。

第四節(jié)  超抗原

超抗原（superantigen，SAg)的概念最早由White于1989年提出，它是一類具有多種免疫活性的蛋白分子，由某些細(xì)菌、病毒、支原體等產(chǎn)生，故涉及到免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和傳染病學(xué)等范疇。了解細(xì)菌超抗原的生物學(xué)特性，有助于闡明其產(chǎn)生菌所致疾病的免疫學(xué)發(fā)病機制。

一、特   點

與普通抗原（conventionalantigen)相比，細(xì)菌毒素超抗原具有以下顯著特點：

1．只需極低濃度（1-10ng/ml)即可刺激強烈的初次免疫應(yīng)答，可激活的T淋巴細(xì)胞的數(shù)量比普通抗原多達數(shù)千倍，且沒有初次和再次免疫應(yīng)答的區(qū)別，故稱為超抗原。而普通抗原必須在體內(nèi)引導(dǎo)（priming)和加強（boosting)后，才能在體外檢測到T細(xì)胞增殖反應(yīng)。

2．不經(jīng)抗原提呈細(xì)胞（antigenpresenting cells，APC)加工處理，可以完整的蛋白分子形式直接與抗原提呈細(xì)胞膜上的MHCⅡ類分子及T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR)Vβ區(qū)非特異性結(jié)合，激活T細(xì)胞增殖。而普通抗原則需經(jīng)APC降解成短肽后，才能提呈于MHCⅡ類分子肽鏈結(jié)合的溝槽內(nèi)。

圖3-15  超抗原與TCRMHC-Ⅱ分子結(jié)合示意圖

3．結(jié)合部位不在抗原肽結(jié)合的溝槽內(nèi)，而在溝槽外側(cè)。具有雙結(jié)合功能，能同時與APC膜上的MHC-Ⅱ-α/β鏈及T細(xì)胞膜上的TCR-β鏈可變區(qū)（Vβ)結(jié)合（圖3-15)，一般一種SAg只選擇性地激活某些Vβ類型的T細(xì)胞克隆。

4．與TCR結(jié)合時，只涉及TCR Vβ的抗原受體互補決定區(qū)（CDR)2和CDR1，不涉及Vβ的CDR3和TCRα的識別，故T細(xì)胞對超抗原的反應(yīng)不受MHCⅡ類分子的限制，這違背MHC限制的“黃金規(guī)則”（thegolden rule of mhc restriction)。普通抗原特異細(xì)胞反應(yīng)都受MHC限制。

二、分   類

超抗原（SAg)由某些細(xì)菌、病毒（如人類免疫缺陷病毒、鼠乳腺瘤病毒、狂犬病病毒、EB病毒)和支原體產(chǎn)生。根據(jù)產(chǎn)生菌、作用靶細(xì)胞、分子結(jié)構(gòu)特點及其與MHCⅡ類分子結(jié)合方式的不同，可將細(xì)菌毒素性超抗原作以下分類（表3-3)。

表3-3 細(xì)菌毒素超抗原的種類

分 類 依 據(jù)	種   類
產(chǎn)生菌 作用靶細(xì)胞 分子結(jié)構(gòu)特點	葡萄球菌腸毒素（staphylococcus enterotoxin，SEs) 毒性休克綜合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1) 鏈球菌致熱外毒素（streptococcus pyrogenic exotoxin，SPEs) T細(xì)胞SAg B細(xì)胞SAg Zn2+協(xié)調(diào)亞家族（包括SEA、C、D、E、H、I和SPE) 非Zn2+依賴亞家族（包括SEB、G和TSST-1)

細(xì)菌毒素SAg是單肽鏈分子，大小約200～240aa（約22～30kDa)，多數(shù)SAg肽鏈中段有1個二硫鍵，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

Zn²⁺協(xié)調(diào)亞家族SAg的突出特點是，具有2個MHCⅡ類分子結(jié)合部位，一是N端暴露于肽鏈三維結(jié)構(gòu)表面的疏水性“F-L”結(jié)構(gòu)，對MHCⅡ類分子α鏈有低親和力；二是肽鏈中部或C端，是一個保守Zn²⁺結(jié)合結(jié)構(gòu)，內(nèi)含3個Zn²⁺配體（一般是His和Asp)。這3個配體在三維結(jié)構(gòu)中聚在一起，可與Zn²⁺結(jié)合，從而協(xié)調(diào)和穩(wěn)定SAg與MHCⅡ類分子β鏈高親和性結(jié)合。非Zn²⁺依賴亞家族SAg沒有Zn²⁺結(jié)構(gòu)，只有N端的F-L結(jié)構(gòu)，對MHCⅡ類分子α鏈有低親和性。

三、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答機制

（一)激活MHC表達細(xì)胞

超抗原不需要抗原提呈細(xì)胞（APC)的加工處理，但在大多數(shù)情況下，依賴于MHCⅡ類分子的提呈。不同的SAg激活MHC表達細(xì)胞（如單核-吞噬細(xì)胞、B細(xì)胞等)的機制是不相同的。

Zn^2＋協(xié)調(diào)亞家族SAg  Zn^2＋協(xié)調(diào)SAg以二種形式與MHCⅡ類分子結(jié)合：①單體分子：1個SAg單體分子只能與MHCⅡ類分子的其中一條肽鏈結(jié)合，形成二或三聚體，如SED-MHCβ和MHCβ-SED-MHCα等；②雙體分子：在Zn^2＋協(xié)調(diào)下，Zn^2＋協(xié)調(diào)SAg可形成穩(wěn)定的同型二聚體，繼而促使MHCⅡ類分子雙聚化，即同時結(jié)合2個MHCⅡ類分子形成四聚體，如MHCβ-SED-SED-MHCβ和MHCβ- SED-SED-MHCα。MHCⅡ類分子雙聚化是誘導(dǎo)MHCⅡ類分子表達細(xì)胞活化的前提。因此，Zn^2＋協(xié)調(diào)SAg可直接激活單核細(xì)胞。

Zn^2＋協(xié)調(diào)SAg與所有MHCⅡ類分子表達細(xì)胞均可高親和性結(jié)合，結(jié)合位點在MHCⅡ類分子β鏈抗原結(jié)合槽外側(cè)的1個α螺旋上（圖3-16)，故不受MHCⅡ類分子多態(tài)性的限制，即一種SAg可以和任何一種MHCⅡ類分子結(jié)合。

非Zn^2＋依賴亞家族SAg  由于沒有Zn^2＋結(jié)合區(qū)，SAg不能形成同型二聚體。SAg肽鏈上只有N端1個低親和性結(jié)合區(qū)，所以只能與1個MHCⅡ類分子α鏈結(jié)合，如SEB只能形成SEB-MHCα等二聚體分子。非Zn^2＋依賴SAg單體分子不能使MHCⅡ類分子雙聚化，因而不能直接活化單核細(xì)胞。但通過刺激單核細(xì)胞膜CD40分子產(chǎn)生協(xié)同刺激信號，可彌補非Zn^2＋依賴SAg不能雙聚化這一缺陷而激活單核細(xì)胞。

（二)激活T細(xì)胞

SAg與MHCⅡ類分子結(jié)合后，由APC提呈直接與TCR-Vβ連接，由于連接位點在抗原結(jié)合溝槽外側(cè)（圖3-16)，因而這一過程不受TCR∶MHC及CD4∶MHC反應(yīng)的限制。SAg活化T細(xì)胞時，不像普通抗原同時受TCRVα-Jα和Vβ-Dβ-Jβ多重限制，它們只與TCR-Vβ結(jié)合。由于人TCR-Vβ基因只有20余種，而一種SAg一般可選擇地與幾種TCR-Vβ分子相互作用，因此，SAg可激活大量的T細(xì)胞，即激活T細(xì)胞的百分比顯著增加，大約占T細(xì)胞的10%～30%，比普通抗原高出數(shù)百倍以上。由于SAg具有強大的T細(xì)胞激活功能，可為抗腫瘤的靶向治療和疫苗佐劑研制提供新的思路。

目前認(rèn)為，SAg活化T細(xì)胞時，也需要CD80/ CD 86對T細(xì)胞上CD28的協(xié)同刺激，如果缺乏協(xié)同刺激作用，則T細(xì)胞的應(yīng)答處于無能（angergy)狀態(tài)，增殖水平很低，產(chǎn)生的細(xì)胞因子也極少。這也說明，大多數(shù)SAg之所以選擇MHCⅡ類分子作為特異受體，可能是由于表達高水平MHCⅡ類分子的APC可同時表達高水平的協(xié)同刺激分子CD80/CD86。此外，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SAg可不依賴于MHCⅡ類分子，直接與TCR結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化。

在體內(nèi)，給予SAg可誘發(fā)廣泛T細(xì)胞激活。T細(xì)胞先是數(shù)目增加，但數(shù)天后迅速減少，出現(xiàn)免疫抑制。T細(xì)胞減少是由于T細(xì)胞凋亡所致，可能是由Fas/FasL途徑介導(dǎo)的。另外還發(fā)現(xiàn)，SAg可以通過TCRVβ(T)-SAg-MHCⅡ(B)的方式誘導(dǎo)B細(xì)胞活化�；罨�的B細(xì)胞可表達CD40和高水平的FasL，從而誘導(dǎo)表達Fas的T細(xì)胞發(fā)生凋亡。

SAg不僅可以激活T細(xì)胞，還可誘導(dǎo)其發(fā)生免疫耐受性，表現(xiàn)為再次接受SAg刺激時，相應(yīng)TCRVβ特異性T細(xì)胞增殖水平和IL-2的合成量大幅度降低或減少。

可見，深入研究超抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、凋亡和免疫無反應(yīng)性的機制，將有助于闡明淋巴細(xì)胞對自身抗原的免疫耐受機制和自身免疫病的發(fā)生機制，尋找阻止或逆轉(zhuǎn)免疫耐受的方法，為超抗原用于抗腫瘤治療提供理論依據(jù)。

（三)對B細(xì)胞的影響 

SAg對B細(xì)胞可產(chǎn)生顯著影響，因為B細(xì)胞表達MHCⅡ類分子，可作為SAg提呈細(xì)胞。超抗原不能單獨引起高度純化B細(xì)胞的增生和分化成為抗體生成細(xì)胞，但在T細(xì)胞存在下，可誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖，并促進其分化成為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。SEA和SED能低親和性地結(jié)合于表達特定可變區(qū)重鏈（V_H)的B細(xì)胞膜型免疫球蛋白（mIg)，例如，SEA選擇結(jié)合V_H3-B細(xì)胞，SED結(jié)合V_H4-B細(xì)胞。SEA和SED與V_H結(jié)合的特異性不受mIg的抗原結(jié)合溝槽、D區(qū)和J_H的限制，其結(jié)合位點在抗原結(jié)合溝槽外側(cè)的FR1和FR3肽段。SAg與表達MHCⅡ類分子的細(xì)胞結(jié)合后，有可能先活化這些細(xì)胞，然后再誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

此外，SAg結(jié)合在MHCⅡ類分子的抗原結(jié)合溝槽外側(cè)，并不影響MHCⅡ類分子與普通抗原結(jié)合。但與MHCⅡ類分子結(jié)合的SAg，可能影響T細(xì)胞對APC提呈的普通抗原的應(yīng)答。

四、生物學(xué)效應(yīng)

超抗原作為一類強大的免疫激活因子，可活化T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，其作用范圍從T細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)，眾多細(xì)胞因子釋放，免疫抑制到免疫耐受和免疫無反應(yīng)性。細(xì)菌毒素超抗原的生物學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)在2個方面：

對免疫系統(tǒng)的直接效應(yīng)  SAg可以超常量激活T細(xì)胞和MHC表達細(xì)胞，由于T細(xì)胞被大量激活后，隨之出現(xiàn)凋亡，T細(xì)胞數(shù)量減少，必然使宿主免疫功能下降，繼發(fā)免疫抑制。此外，SAg還可能大量激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞，有些B細(xì)胞可以持續(xù)地多克隆增殖分化，產(chǎn)生自身抗體，因而引起自身免疫病。如鏈球菌致熱外毒素除能特異性增強鏈球菌溶素O對心臟的毒性作用外，還能刺激T細(xì)胞增殖，促進自身免疫病（風(fēng)濕熱)的發(fā)生。

由細(xì)胞因子介導(dǎo)的間接效應(yīng)  SAg超常量激活T細(xì)胞和MHC表達細(xì)胞，使它們分泌過量的細(xì)胞因子，尤其是IL-1、IL-2、IL-6、TNF和IFN-γ等，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)嚴(yán)重紊亂，往往對機體產(chǎn)生毒性效應(yīng)，如體溫升高，炎性細(xì)胞浸潤，血管內(nèi)皮細(xì)胞或其它細(xì)胞損傷，釋放生物活性介質(zhì)，滲透壓平衡失調(diào)，增加機體對內(nèi)毒素及其它毒素的敏感性等。因此，SAg與毒性休克綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、川崎綜合征（kawaseki syndrome)、嬰兒突然死亡綜合征、食物中毒、猩紅熱、銀屑病（牛皮癬)等都有密切關(guān)系。如INF與IFN-γ在葡萄球菌腸毒素B（SEB)引發(fā)的休克中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

第五節(jié) 脂多糖

脂多糖（LPS)主要毒性成分脂質(zhì)A與內(nèi)毒素受體相互作用后，可誘導(dǎo)前炎癥細(xì)胞因子系統(tǒng)而介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)毒素休克甚至多器官功能障礙綜合征，病死率高達50%以上。因此，探討LPS的分子致病機制，尋找有效的LPS干預(yù)途徑具有重要意義。

一、分子結(jié)構(gòu)特點

LPS由O-特異性多糖鏈（O-specificpolysaccharide chain)、核心多糖（core oligosaccharide)和脂質(zhì)A或類脂A（lipid A)通過共價鍵依此連接而成（圖3-16)，依靠脂質(zhì)A錨在革蘭陰性菌細(xì)胞外膜磷脂層上。

O-特異性多糖主糖鏈  由0～50個寡糖重復(fù)單位構(gòu)成，每個重復(fù)單位含3～6個單糖分子。單糖種類有戊糖、氨基戊糖、己糖、氨基己糖、脫氧己糖等。O-特異性多糖變異性最大，如沙門菌A、B、D和E血清群的O-多糖鏈由“甘露糖-鼠李糖-半乳糖”三糖重復(fù)單位組成，C₂群的紐波特沙門菌則由“鼠李糖-甘露糖-甘露糖-半乳糖”四糖單位組成。沙門菌A、B、D和E血清群主糖鏈相同，但支糖鏈不同。因此，單糖的種類、數(shù)目、排列順序和糖鏈的空間構(gòu)象等構(gòu)成了細(xì)菌的O抗原決定簇。

核心多糖  位于O-特異性多糖鏈與脂質(zhì)A之間，由外核和內(nèi)核組成。外核由3個己糖構(gòu)成糖鏈骨架，此骨架因菌而異，例如，所有沙門菌的外核骨架是“Glc-Gal-Glc”（Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖)，但大腸埃希菌比較多樣化，如大腸埃希菌K-12菌株是“Glc-Glc-Glc”，R4株是“Gal-Glc-Glc”，外核骨架上可連接不同的側(cè)鏈，一般是己糖或氨基己糖。內(nèi)核是高度保守的，絕大多數(shù)由3個L-甘油型庚糖（L-glyceroheptose，Hep)和1～3個2-酮-3-脫氧-D-甘露醇型辛酮糖酸（2-keto-3-deoxy-D-mannooctonate，KDO)構(gòu)成。

脂質(zhì)A  是LPS分子中最保守的部分，基本骨架由2個D-氨基葡萄糖（D-GlcN)以β-1,6糖苷鍵連接構(gòu)成，通過非還原端D-GlcN6’位的α-糖苷鍵與KDO連接。脂質(zhì)A的D-GlcN雙糖上可連接多個基團，如圖3-17所示，還原端D-GlcN（1)和非還原端D-GlcN（2)各有1個磷酸基團，其上可分別接R1和R2，如在大腸埃希菌R1是磷酸基團，R2是KDO。每個D-GlcN的C2-NH₂和C3-OH上可以各連接1個長鏈C3-OH-脂肪酸分子或1個(C3-O-脂肪酰)-脂肪酸分子。

圖3-18  大腸埃希菌脂質(zhì)A化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

連接的脂肪酸分子因菌而異，且與脂質(zhì)A毒性密切相關(guān)。一般連接6個脂肪酸分子的脂質(zhì)A毒性最強，多于或少于6個，毒性則減弱。如大腸埃希菌脂質(zhì)A的D-GlcN雙糖上連有6個脂肪酸分子，沙門菌脂質(zhì)A雙糖連接7個脂肪酸分子，其LPS的活性比大腸埃希菌的要低。

二、LPS受體及入胞方式

病原微生物侵入人體后，先天免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等依靠一組 “特式識別受體”(pattern recognition receptors，PRRs)，如CD14、Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)、ß2-整合素 (ß2-integrins, CD11/CD18)、巨噬細(xì)胞清道夫受體(macrophage scavengerreceptors)、補體受體CR1/CR2等識別“病原體相關(guān)分子特式結(jié)構(gòu)” (pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。PAMPs包括革蘭陰性菌的脂多糖（LPS)和脂蛋白，革蘭陽性菌的肽聚糖和脂磷壁酸等。免疫細(xì)胞最重要的PRRs是CD14和TLRs。一旦PRR識別某一PAMPs后，這些效應(yīng)細(xì)胞立即發(fā)揮作用。

LPS受體  LPS與宿主細(xì)胞的結(jié)合方式有兩種：①非特異性結(jié)合：LPS的脂質(zhì)A通過親脂性的疏水作用與細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，從而改變磷脂膜結(jié)構(gòu)的物理和化學(xué)性質(zhì)（如膜完整性、流動性、膜電勢等)，產(chǎn)生相應(yīng)信號轉(zhuǎn)膜傳導(dǎo)，影響細(xì)胞的狀態(tài)和功能；②特異性結(jié)合：LPS通過脂質(zhì)A與相應(yīng)膜受體特異性結(jié)合。LPS的膜受體可能有多種，比較肯定的是CD14。

CD14（55kDa)有二種：一種是游離于血清中，稱為可溶性CD14（sCD14)，另一種借助糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨著于髓源性細(xì)胞（單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)膜上，稱為膜CD14（mCD14)。CD14一般不能直接與LPS結(jié)合，需借助LPS結(jié)合蛋白（LPSbinding protein，LBP)才能結(jié)合。

LBP（60kDa)是一種由肝細(xì)胞合成的急性期血清糖蛋白，對LPS脂質(zhì)A有高度親和性。LBP被認(rèn)為是往返運輸微生物產(chǎn)物至CD14 的載體，其N端與LPS結(jié)合，C端與s/mCD14結(jié)合，形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物，將LPS轉(zhuǎn)遞給CD14，其中sCD14可攜帶LPS粘附于不表達mCD14的細(xì)胞（如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)。LPS的許多生物學(xué)效應(yīng)是通過LBP/CD14介導(dǎo)的，LBP/CD14系統(tǒng)具有增敏內(nèi)毒素的作用。因此，LBP抗體可保護機體免受LPS攻擊。

入胞方式  LPS可能以兩種方式進入細(xì)胞：①聚集的LPS或整個細(xì)菌與mCD14結(jié)合，然后內(nèi)吞進入細(xì)胞，并被運送至溶酶體內(nèi)，最終被溶酶體酶降解；②LBP催化LPS單體分子與s/mCD14結(jié)合，然后以LPS-LBP-mCD14復(fù)合物的形式內(nèi)在化進入細(xì)胞，最終聚集在高爾基體內(nèi)。

在LPS與mCD14結(jié)合及內(nèi)在化過程中可發(fā)生激活TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但由于mCD14只是借助GPI錨著于細(xì)胞膜上，沒有跨膜區(qū)，因此沒有能力啟動一個跨膜的活化信號，須依賴其它跨膜蛋白分子傳導(dǎo)LPS信號。

三、LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑—IκB/NF-κB系統(tǒng)

Toll樣受體  1988年，Hashimoto等發(fā)現(xiàn)在果蠅細(xì)胞膜上有一種屬于Ⅰ類跨膜蛋白的受體，稱為Toll受體，最初被確定與果蠅胚胎發(fā)育及防御作用有關(guān)。后來發(fā)現(xiàn)從昆蟲到人都有氨基酸序列同源性極高的Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs)家族，該家族成員屬于先天免疫系統(tǒng)，參與非特異性免疫防御的各種細(xì)胞精確識別病原體相關(guān)分子。TLRs由胞外結(jié)構(gòu)域（domain)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與Ⅰ型IL-1R的胞漿信號區(qū)有顯著的同源性，因而被認(rèn)為屬于IL-1R超家族。目前已確定了10種人類TLR的全長基因，其中研究較多的是TLR4和TLR2。

TLRs主要表達在單核-巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞膜上，這些都是在感染早期直接接觸微生物的細(xì)胞。TLRs胞外結(jié)構(gòu)域有多個富含亮氨酸重復(fù)序列拷貝，可以識別和結(jié)合病原微生物或其產(chǎn)物，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，如可接受CD14轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有Toll/IL-1R(TIR)模塊，與細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白MyD88和IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)的復(fù)合物相連接。目前認(rèn)為，TLRs可能可以啟動多條信號傳導(dǎo)途徑，但其中最重要的是核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclearfactor，NF-κB)途徑。

NF-κB  在細(xì)胞內(nèi)，存在著一個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的IκB/NF-κB系統(tǒng)。最初，NF -κB作為一種結(jié)合于基因增強子的轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)識，但現(xiàn)在證實它們對許多基因，包括免疫防御、炎癥和凋亡過程的基因表達起著中心調(diào)控作用。已發(fā)現(xiàn)5種NF-κB蛋白，在所有NF-κB蛋白N末端都有1個高度保守的Rel同源區(qū)(RHD),NF-κB分子通常依靠RHD連接形成二聚體分子，其RHD區(qū)結(jié)合有DNA和抑制蛋白IκBs。IκBs也是多基因家族，在哺乳動物已發(fā)現(xiàn)7種IκBs蛋白。IκB家族蛋白肽鏈上有多個錨蛋白重復(fù)拷貝，這些錨蛋白是蛋白連接模塊，可與NF-κB的RHD連接。

在靜息細(xì)胞內(nèi)，NF-κB雙聚體與IκBs結(jié)合，以非活化形式停留在細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到病原微生物感染、脂多糖、細(xì)胞因子等刺激后，NF-κB可被激活，啟動基因的轉(zhuǎn)錄（參見第4章)。

LPS激活TLR4的信號途徑 Toll樣受體是LPS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的輔助受體�，F(xiàn)已證實，TLR4和TLR2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在微妙的差異，TLR4由于結(jié)合了MD-2 分子，具有LPS應(yīng)答能力，可能是G^－菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，而TLR2主要作為G^＋菌和酵母菌的識別和激活受體。

在 MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，革蘭陰性菌釋放的LPS在血流中與LBP結(jié)合形成復(fù)合物，然后與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的mCD14結(jié)合，LPS、LBP和CD14三者相互作用，導(dǎo)致TLR4同型二聚體的胞內(nèi)TIR區(qū)發(fā)生構(gòu)象改變，從而能募集并激活轉(zhuǎn)接蛋白MyD88。之后，由MyD88與IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK)的N端死亡結(jié)構(gòu)域連接而導(dǎo)致IRAK自動磷酸化，激活的IRAK從受體復(fù)合物解離，繼而激活TNF受體相關(guān)因子6（TNFreceptor-associated factor 6，TRAF6)，由后者再激活絲裂原活化蛋白3激酶（mitogen-activatedprotein 3 kinase，MAP3K)家族成員TAK-1。該激酶激活后，進一步活化IκB激酶(IκB kinases，IKKs)復(fù)合物�；罨�的IKKs將IκB磷酸化，隨后磷酸化的IκB被一種26S的蛋白酶降解，NF-κB被解除抑制，游離釋放，并移位進入細(xì)胞核內(nèi)，與κB基序（κBmotif)結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮調(diào)控作用，誘發(fā)一系列免疫炎癥反應(yīng)（圖4-19)。

TLRs及其胞內(nèi)信號傳遞分子的發(fā)現(xiàn)，將有助于闡明LPS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，為治療內(nèi)毒素休克這一致死性的臨床綜合征提供新的思路。

四、LPS生物學(xué)效應(yīng)

NF-κB調(diào)控的靶基因大致有以下幾種：

參與炎癥和早期防御的基因  所編碼的主要產(chǎn)物有：①細(xì)胞因子，如TNF-α、GM-CSF、IL-1/-2/-6/-12；②細(xì)胞粘附分子，如細(xì)胞間粘附分子（ICAM)、血管細(xì)胞粘附分子（VCAM)、E選擇素（ELAM)；③急性期蛋白；④誘導(dǎo)酶，如誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（induciblenitric oxide synthase，INOS)；⑤抗菌多肽，如ß-防御素（β-defensins)。這些產(chǎn)物直接參與炎癥反應(yīng)和非特異性抗菌反應(yīng)，也誘導(dǎo)協(xié)同刺激分子CD80的表達。

參與特異性免疫的基因  主要包括MHC、IL-2/12、IFN-γ、協(xié)同刺激分子CD80（B7-1)和CD86（B7-2)的編碼基因。這些基因產(chǎn)物可協(xié)同激活特異性免疫細(xì)胞，并參與調(diào)控特異性免疫應(yīng)答。如CD80/CD86與CD28結(jié)合為T細(xì)胞TCR-CD3活化途徑提供重要的協(xié)同刺激信號（co-stimulatingsignal)。

編碼影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白的基因  如c-IAP-1/-2、Fas配體、c-myc、p53等的編碼基因，這些產(chǎn)物可啟動細(xì)胞凋亡過程（參見第4章)。

可見，LPS一般不直接損傷各種組織器官的細(xì)胞，而是通過刺激參與先天免疫防御的各種免疫細(xì)胞和內(nèi)皮/粘膜細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、炎癥因子、急性期蛋白、活性氧/氮分子、抗菌多肽，以及激活特異性免疫細(xì)胞，引起各種組織器官以及全身性多種病理生理反應(yīng)。主要臨床癥狀有發(fā)熱、白細(xì)胞數(shù)目改變、Shwartzman反應(yīng)、DIC、內(nèi)毒素血癥、休克等。

第六節(jié)  細(xì)菌毒素在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

細(xì)菌毒素可用于制備疫苗或抗毒素等生物制品，以預(yù)防或治療相應(yīng)毒素中毒癥以外，在醫(yī)學(xué)上還有多種用途。細(xì)菌毒素可作為一個有效、特異的手段，應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)（毒素內(nèi)在化的路徑及其與細(xì)胞器的相互作用、越膜信號、G蛋白)、神經(jīng)生物學(xué)（神經(jīng)介質(zhì)的釋放、與突觸囊泡的相互作用)、免疫學(xué)（單克隆抗體、細(xì)胞因子)、藥學(xué)（炎癥因子的釋放)。有目的地選擇細(xì)胞特異受體或胞膜分子，可設(shè)計新的以天然、合成或重組毒素為基礎(chǔ)的免疫原作為疫苗和有效藥物或潛在的抗腫瘤或抗病毒療法。

一、藥物

厭氧芽孢梭菌屬細(xì)菌能產(chǎn)生很多毒素，統(tǒng)稱為梭菌毒素，其中許多可能用作臨床藥物。在一些國家，BoNT-A已經(jīng)準(zhǔn)許有限制地用于臨床治療，主要治療許多痙攣性病癥和痛癥，如不隨意�。ㄎ�、腸、血管、心肌等)痙攣、張力障礙、局部肌肉痙攣、肌筋膜痛等，特別是治療麻痹性斜視、緊張性頭痛和偏頭痛較為成功。

體外試驗表明，TcdA、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素等可損傷多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系。在動物實驗中，TcdA還表現(xiàn)出優(yōu)先選擇癌變細(xì)胞，可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。已有人提出用TcdA治療結(jié)腸癌和胰腺癌。

已證實TcdA和BoNT-C2粘附于肥大細(xì)胞后可誘導(dǎo)其脫顆粒，TcdA還可引起微循環(huán)障礙，因此TcdA和BoNT/C2可用于調(diào)控變態(tài)反應(yīng)和治療炎癥。

LPS也有抗腫瘤作用。19世紀(jì)美國人Coley曾用滅活的化膿性鏈球菌和靈桿菌濾液制成“Coley毒素”用于治療腫瘤病人，取得較為肯定的療效，Coley毒素的本質(zhì)就是LPS。據(jù)報道，在臨床上用綠膿桿菌菌苗治療腫瘤患者，5年存活率高于化療患者。LPS的抗腫瘤機制尚未完全闡明，但其引起的微循環(huán)障礙和血管內(nèi)皮損傷，可以導(dǎo)致腫瘤先缺血后出血性壞死。此外，LPS還可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF、IFNs、ILs等多種細(xì)胞因子，可活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，均可參與抗腫瘤作用。

二、免疫調(diào)節(jié)

LPS可以活化單核-巨噬細(xì)胞等，分泌多種細(xì)胞因子，增強宿主的非特異性免疫功能。但由于LPS的毒性多樣且復(fù)雜，用于臨床難以控制，目前有不少研究者正在使用物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，制取或?qū)ふ覠o毒或減毒的變異LPS及其衍生物，用于動物抗腫瘤實驗。

SAg具有抗腫瘤效應(yīng)。一方面，SAg可大量激活CD8^＋Tc細(xì)胞；另一方面，SAg可與MHCⅡ類分子結(jié)合，刺激CD4^＋T細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如TNF-γ、IFNs、ILs等，這些細(xì)胞因子可進一步活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，從而發(fā)揮自然殺傷作用，顯示抗腫瘤效應(yīng)。此外，TNF-γ、IFNs等細(xì)胞因子又可促進腫瘤細(xì)胞對MHCⅡ類分子的表達，增強抑瘤效果。因此，SAg有可能成為一類抗腫瘤新藥。已有一些SAg的體外或?qū)嶒瀯游锟鼓[瘤實驗的報告，如SE-A或SE-B可殺傷體外培養(yǎng)的表達MHCⅡ類分子的結(jié)腸癌細(xì)胞，對不表達MHCⅡ類分子的腫瘤細(xì)胞也可產(chǎn)生間接的旁觀者效應(yīng)。

三、免疫毒素

概念  免疫毒素（immunotoxins，ITs)是人工制備的導(dǎo)向療法生物制品，由選擇特定靶細(xì)胞的定位部分（導(dǎo)向載體)及殺傷靶細(xì)胞的治療部分（彈頭)構(gòu)建而成。

ITs的定位部分也稱為導(dǎo)向成份（targetingmoiety)，它的作用是代替毒素的結(jié)合區(qū)，因此必須對靶細(xì)胞有高度特異性和高親和力。導(dǎo)向成份一般選擇較小分子量的生物成份，如針對靶細(xì)胞膜表面抗原的McAb或它的可變區(qū)片段（fragmentvariable，F(xiàn)v)，或是膜受體的相應(yīng)配體，如細(xì)胞因子、生長因子、激素和CD抗原分子等。如制備治療T細(xì)胞白血病和淋巴瘤的ITs，導(dǎo)向成份可選用IL-2或IL-4；治療上皮癌的ITs可選用表皮生長因子（表3-4)。

ITs的治療部分一般選用生物毒素或化學(xué)制劑。常用的生物毒素有植物毒素、真菌毒素和細(xì)菌毒素。細(xì)菌毒素由于分子小且結(jié)構(gòu)較簡單，生物活性高，比較容易與導(dǎo)向成份連接，以及容易大量獲取，所以較適宜制備ITs。目前用得最多的是DT、PEA和溶細(xì)胞毒素等（表3-4)。此外還可用雜合毒素（如蓖麻毒素-PEA)或雙彈頭毒素（一個載體連接兩種毒素)。

表3-4 部分免疫毒素和相關(guān)疾病

靶細(xì)胞受體	免疫毒素	臨床適應(yīng)癥
IL-2R IL-4R IL-6R IL-9R EGF-R FGF-R GM-CSF-R 轉(zhuǎn)鐵蛋白 HIV gp120	IL-2-PE40、IL-2-DT IL-4-PE40 IL-6-PE40 IL-9-ETA PE40-TGFα FGF-PE DT-GM-CSF 抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白-DT gp120單抗（Fab)-PE基因	淋巴瘤、自身免疫病、AIDS 淋巴瘤、膠質(zhì)瘤 koposi瘤 霍奇金病、淋巴瘤 多種腫瘤 肢體先兆局部缺血 淋巴瘤、白血病 腦腫瘤 AIDS

化學(xué)交聯(lián)免疫毒素  利用活潑的化學(xué)交聯(lián)劑，修飾完整毒素和抗體（多為鼠源性)純化蛋白分子肽鏈上的某種化學(xué)基團，將兩者以共價鍵連接而成。這種免疫毒素分子量大、免疫原性大、組成不均一、穿透力弱，因此，在臨床應(yīng)用上受到限制。

重組免疫毒素（recombinant　immunotoxin)  利用克隆技術(shù)獲取細(xì)菌毒素（如DT-A或PEA-Ⅲ區(qū)編碼ADPR轉(zhuǎn)移酶肽段)的編碼基因，通過DNA連接酶與導(dǎo)向因子（如抗體、生長因子等)的基因片段連接，構(gòu)建成重組免疫毒素基因，克隆至高表達質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入大腸埃希菌等原核細(xì)胞中表達。細(xì)菌大量培養(yǎng)后，收集菌體并破碎之，提純獲得免疫毒素。為增加重組免疫毒素的穿透力和降低抗體的免疫原性，可采用基因重組技術(shù)，構(gòu)建單鏈抗體、二硫鍵抗體等小抗體分子和人源化抗體。但是，重組免疫毒素仍存在非特異性殺傷作用、調(diào)節(jié)手段少等缺點，對實體瘤的穿透力仍然很弱。

基因免疫毒素（genetic immunotoxin)  彈頭部分不是毒素，而是攜帶毒素編碼基因的重組質(zhì)粒（圖3-20)。質(zhì)粒在某個細(xì)胞系相關(guān)的真核啟動子/增強子控制下，由導(dǎo)向載體引入靶細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)后即可表達毒素。導(dǎo)向部分是人源單鏈抗體和堿性的魚精蛋白的基因融合表達產(chǎn)物。魚精蛋白帶有很強的正電荷，能與質(zhì)粒DNA牢固結(jié)合。基因免疫毒素具有高特異性、更低的免疫原性、更強的細(xì)胞毒性、更長的藥物持久性和可控性，在惡性腫瘤的治療上將具有很大潛力。

圖3-20  常規(guī)免疫毒素與基因免疫毒素的結(jié)構(gòu)示意圖

目前已有一些ITs在臨床Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期試驗中取得一定效果，主要用于治療癌癥、自身免疫病、移植物抗宿主反應(yīng)（graft-versus-hostdisease，GVHD)和AIDS等。

四、醫(yī)學(xué)研究

許多梭菌毒素已經(jīng)用作醫(yī)學(xué)研究的材料或工具。如在實驗動物的大腦海馬部注入TeNT，已建立了慢性癲癇綜合癥的動物模型。通過研究這一動物模型的行為變化、局部或全身性癲癇發(fā)作、模擬人類與肢體癲癇有關(guān)的學(xué)習(xí)無能及臨床心理變化，可以更深入地研究癲癇病的臨床表現(xiàn)及對機體生理的影響，尋找治療癲癇的方法和藥物等。通過研究這種動物模型，研究者已經(jīng)提出一種值得注意的假說：梭菌如破傷風(fēng)梭菌或肉毒梭菌在腸道內(nèi)寄生或感染，或許不會引起明顯的由TeNT或BoNTs引起的痙攣或麻痹，但可能通過腸道微量吸收這些毒素而使某些人處于一種慢性疾病狀態(tài)，如孤獨癥。

在實驗動物體內(nèi)證實，TeNT比任何一種蛋白都更快速地從循環(huán)系統(tǒng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。TeNT的含有R區(qū)的Hc肽段對機體是無毒的，將治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物或蛋白分子與Hc肽段連接，利用Hc肽段將藥物分子快速送進中樞神經(jīng)，可以解決藥物難以進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)困難，對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著重要意義。

動物實驗表明，LT與CT具有粘膜免疫佐劑作用。有相當(dāng)多的抗原單獨口服不會誘導(dǎo)粘膜局部免疫應(yīng)答或容易引起免疫耐受，但如果與LT或CT同時口服，則可產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答。而用LT-B或CT-B作為佐劑，免疫誘導(dǎo)作用不明顯，須在B亞單位佐劑中加入微量全毒素才能表現(xiàn)較好的佐劑作用，這表明LT或CT的佐劑作用可能要依賴于A亞單位的ADPR轉(zhuǎn)移酶活性，但LT或CT的毒性限制了它們的應(yīng)用。如何將LT或CT改造為無毒的免疫佐劑已成為研究熱點。

（劉琥琥  廣東藥學(xué)院)