溶組織內(nèi)阿米巴培養(yǎng)方法

當(dāng)受檢者疑有溶組織內(nèi)阿米巴感染，而直接糞便檢查為陰性時，可作阿米巴人工培養(yǎng)，培養(yǎng)方法有常規(guī)培養(yǎng)、有菌培養(yǎng)和無菌培養(yǎng)。

（一) 常規(guī)培養(yǎng)

取膿液、粘液處稀便0．5 ml，或黃豆大小的成形便，直接接種至試管內(nèi)與執(zhí)業(yè)醫(yī)師網(wǎng)培養(yǎng)液混勻；或?qū)⒓S便自然沉淀后，取沉淀物0．5 ml 接種至試管內(nèi)。置試管于37℃溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后24小時、48小時、72小時取培養(yǎng)液中的混濁部分涂片鏡檢， 查出蟲體即可確診。

常用的培養(yǎng)基有營養(yǎng)瓊脂雙相培養(yǎng)基和洛克氏液雞蛋血清培養(yǎng)基：

1．營養(yǎng)瓊脂雙相培養(yǎng)基

分固相和液相兩部分：

（1) 固相部分：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，瓊脂15g，NaCl8g，蒸餾水1000 ml。

（2) 液相部分：NaCl 8g，KCl 0．2g，CaCl₂ 0．2 g，M gCl₂ 0．01g，Na₂HPO₄ 2g，KH₂PO₄ 2g，蒸餾水1000 ml 。

配制液相部分，KCl 和CaCl₂各加少許蒸餾水分別另裝小瓶，高壓滅菌（121℃，20 min)，冷卻后再合并在一起。固相部分的各成分經(jīng)沸水浴2～3 小時完全溶解后（若有殘渣，須經(jīng)4層紗布過濾除渣)，趁熱分裝試管，每管5 ml，加棉塞，高壓滅菌后置成斜面，冷卻后放入4℃ 冰箱備用。接種前每管加液相部分4．5 ml，滅活小牛血清0．5 ml，米粉20 mg（180℃烤箱消毒3次)，青霉素、鏈霉素各1000 U／ml 。

2．洛克液雞蛋血清培養(yǎng)基

培養(yǎng)基成分：洛克液70 ml，滅活馬血清（每管0．5 ml)，米粉（每管20 mg)，雞蛋4個。先配制洛克液：NaCl 9．0g 、CaCl₂ 0．2g、KCl 0．4g、NaHCO₃ 0．2g、葡萄糖2．5g、蒸餾水1000 ml，高壓滅菌（110℃，15 min)。雞蛋用肥皂水刷洗，再用70％酒精抹洗后，破殼裝入有70 ml洛克氏液燒瓶內(nèi)，加玻璃珠充分搖動，分裝至消毒試管內(nèi)，每管約5 ml，斜置并加熱至70℃ 1h使之凝固為斜面，翌日再高壓消毒20分鐘。接種前每管加洛克液4．5 ml，馬血清0．5 ml，無菌米粉20 mg，青霉素、鏈霉素各1000 U／ml 。

（二) 有菌培養(yǎng)（共生培養(yǎng))

在含有瓊脂斜面的6 ml 有螺旋蓋的培養(yǎng)管中加入10 mg米粉、120μl紅霉素液和足夠遮蓋斜面量的鄰苯二甲酸氫鉀（50 mmol，pH6．3，115℃ 20 min高壓滅菌)和BRS液4∶1混合液，加入約50 mg糞便、混勻。37℃培養(yǎng)24小時，傾去培養(yǎng)上清液，再加入適量4∶1 混合液、少量米粉和60 μl 紅霉素液。37℃再培養(yǎng)48小時后，取米粉與糞渣混合物一滴，以碘液染色或直接觀察有無滋養(yǎng)體。若未發(fā)現(xiàn)蟲體，再加入米粉后，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。若有蟲體可將少量培養(yǎng)混合液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)。這種有菌培養(yǎng)方法也可培養(yǎng)結(jié)腸內(nèi)阿米巴、微小內(nèi)蜒阿米巴和哈門氏內(nèi)阿米巴等多種阿米巴。其培養(yǎng)基組成是：

1．瓊脂斜面

15g 瓊脂和7．5g 氯化鈉溶于1000 ml 蒸餾水中，取1．5～2 ml 鹽水瓊脂置于6 ml 培養(yǎng)管中高壓滅菌（121℃，15 min)，當(dāng)冷卻至75℃左右傾放使其形成斜面。

2．紅霉素溶液

在無菌容器中加入20 ml 70％酒精、再加0．5g 紅霉素粉劑溶解后，在4℃放置2小時以上，然后加滅菌水至50 ml 。

3．米粉

大米粉高壓消毒（121℃，30 min) 或180℃干燥滅菌。

4．BRS 溶液

NaCl 50g 、（NH₄)₂SO₄ 10g、檸檬酸（2H₂O)20g、MgSO₄（7H₂O)0．5g、KH₂PO₄ 5g、乳酸（90％純度)4 ml，加水至950 ml，調(diào)節(jié)p H 至7．0，最終調(diào)節(jié)容量至1000 ml，分裝高壓滅菌，制備成貯存液。使用時將100 ml 貯存液加入850 ml 雙蒸水，調(diào)節(jié)p H7．0分裝高壓滅菌，即為R溶液工作液。25 ml R溶液工作液與1個克隆大腸桿菌，37℃ 振搖培養(yǎng)48小時，即為BR溶液。在BR溶液中加入等量血清（56℃ 30 min滅活的牛或馬血清)，繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時，即為BRS溶液。

（三)無菌培養(yǎng)（純種培養(yǎng))

無菌培養(yǎng)主要用于溶組織內(nèi)阿米巴的克隆培養(yǎng)，是在有菌培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將蟲體轉(zhuǎn)種至無菌培養(yǎng)基中，使其逐漸轉(zhuǎn)為無菌培養(yǎng)，并可進(jìn)一步克隆化。由于蟲體對培養(yǎng)基的要求甚高，難度較大，一般不用于臨床檢驗。