五、PCR-SSCP分析技術(shù)
近幾年來,在PCR基礎(chǔ)上完善和發(fā)展起來的多種基因變異檢測方法是基因分析和檢測的一次技術(shù)革命。其中日本學(xué)者創(chuàng)建的PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism anal-ysis of PCR products)格外重要。它是指單鏈DNA分子在變性PAGE中電泳遷移率隨其構(gòu)象的改變而改變的性質(zhì)。單鏈DNA分子的構(gòu)象改變即可由DNA多態(tài)性引起,又可由基因突變引起。為此,有的學(xué)者試圖用PCR-SSGE(Single-Strand Gel Electrophoresis of PCR products)代替原命名。
PCR-SSCP分析包括PCR擴(kuò)增和單鏈產(chǎn)物電泳兩個(gè)階段。對于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物十分有效,對于大于400bp的PCR產(chǎn)物需處理后再分析,必須注意的是PCR-SSCP分析不能確定基因變異部位和內(nèi)容,泳動(dòng)后必須進(jìn)一步完成DNA測序。
六、結(jié)語
PCR技術(shù)以驚人的速度在研究與診斷領(lǐng)域得到應(yīng)用,限于篇幅所限,在此不一一進(jìn)行討論了。本章 重點(diǎn)討論了PCR技術(shù)發(fā)展的有關(guān)內(nèi)容,尤為影響PCR的主要因素和PCR的各種反應(yīng)模式及新進(jìn)展,以求大家在實(shí)際工作中能夠注意到這些問題,并有所創(chuàng)新,相信由于PCR自身高敏感性及實(shí)用性,在分子生物學(xué)研究與醫(yī)學(xué)實(shí)踐中PCR技術(shù)將越來越受到人們的重視。無論從哪一個(gè)角度,PCR技術(shù)從分子水平對許多傳染病、遺傳性疾病和腫瘤進(jìn)行診斷,使法醫(yī)鑒定、生物進(jìn)化的研究更為簡便和強(qiáng)化,在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程與醫(yī)學(xué)研究中都占有重要的地位。
PCR技術(shù)是以生物體內(nèi)DNA復(fù)制為基礎(chǔ)理論的,這一技術(shù)把基礎(chǔ)理論與應(yīng)用有機(jī)結(jié)合起來,給我們以辯證的思考。對于其它學(xué)科中有關(guān)理論與實(shí)踐結(jié)合的問題具有指導(dǎo)意義。PCR技術(shù)必將為我們提供大量有關(guān)核酸的知識(shí),豐富我們的理論,改變我們以前的認(rèn)識(shí),推動(dòng)學(xué)科的向前發(fā)展。
參考文獻(xiàn)
1.L.Z.Xu and D Larzul. The polymerase reaction:Basic Methodology and Applications. Comp.Immun. Microbiol. Infet Dis, 1991, 14(3):209~221
2.Mullis K, Faloona F, Scharf S, Horn G, et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro :the polymerase chain reaction:Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol., 1986,51:263~273
3.Saiki R K, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic aniplification of β-globin genomic sequences and restriction site anylysis for diagnosis of sickle cell anemia.Sciencer, 1985;230:1350~1354
4.Chien A, Edgar D B, Tela J M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile thermus aquaticus. J. Bacterial, 1976;127:1550
5.Saiki RK, Gefland D H, Stoffel S, et al. Primer –directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988;239:487~489
6.黃培堂,等.PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用.科學(xué)出版社.1992
7.朱平,等.PCR聚合酶鏈反應(yīng)操作實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社,1992
8.馬立人,等.PCR技術(shù)的發(fā)展和文獻(xiàn),內(nèi)部資料.
9.金冬雁,等譯.分子克隆操作指南.科學(xué)出版社,1992
10.Wang H C.PCRDESN and PCRDESNA for PCR primer design.Compt. Biol. Med, (insoftware survery section),1991;21(1/2):1
11.Todd Lowe, John Sharefkin, Shi Qiyang, et al. Dieffenbach,A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain Reaction, Nucleic Acids Res, 1990;18:1757~1761
12. Erlich, Eds. New York:PCR Technology. Stockon Press, 1989:17~22
13.Saiki RK, et al. Amplifications, 1989;1:4~6
14.Stoffel. Amplifications , 1991;6:14
15. Eric PH, Yap, James O’ D DcGee. Slide PCR:DNa amplification from cell samples on microscpic glass slides, Nucleic Acids Res.,1991;19(15):4294
16. 馬立人.基因診斷的發(fā)展和應(yīng)用,內(nèi)部資料,1993
17. Takeshi Sano , Cassandral Smith, Charles R, et al. Immuno –PCR:Very sensitive antigen detection by means of specific antibody –DNA conjugates. Science, 1992;258:120~122
18. D Y Kwoh, G R Davis, K M Whitefield , et al.Transcription – hased, amplification system and detection of amplified human immunodefi-ciency virus type1 with a bead based sandwich hybridization format.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989;86:1137~1177
19.Birkenmeyer L G. Isak Mushahwar. DNA probe amplification methods. J Virol. Methods, 1991;35:117~126
20. Barany Francis. Genetic desiease dectection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proc. Natl. Acad, Sci, USA,1991;88:189~193