三、膠體金雙標(biāo)記技術(shù)（常用為蛋白A—膠體金)
1．單面法以不同直徑的金粒分別標(biāo)記兩種不同的抗體，以間接法先染第一種抗體，洗凈后再染第二抗體。
2．雙面法以不同直徑的金粒標(biāo)記的抗體于鎳網(wǎng)的兩面分另進(jìn)行免疫染色。本法的優(yōu)點(diǎn)是可防止兩種金標(biāo)記的抗體的相互干擾，又可防止第一次應(yīng)用的一抗與其相應(yīng)的抗原相結(jié)合，占據(jù)了空間，第二次應(yīng)用的抗體沒有適合的空間使之與相應(yīng)的抗原相結(jié)合。
3．異種動(dòng)物抗原—抗體染色法如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B。第二抗體分別以不同直徑金粒標(biāo)記的抗人和兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會(huì)互相干擾，在應(yīng)用一抗和二抗時(shí)都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。
4．金標(biāo)記抗原檢查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法)此法是Larson（1977)年首先提出的，應(yīng)用放射性同位素如125I或酶標(biāo)記抗原進(jìn)行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應(yīng)，標(biāo)記的純抗原又與特異性抗體反應(yīng)。Larson（1980，1981)又在此基礎(chǔ)上提出應(yīng)用膠體金在電鏡水平進(jìn)行雙抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：雙價(jià)的Ig抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)中有一個(gè)結(jié)合到組織抗原上，而另一端可與標(biāo)記金的抗原起反應(yīng)。雙標(biāo)記時(shí)，預(yù)先將兩種不同的抗原標(biāo)以不同直徑的金粒，可分別與相應(yīng)的第一抗體相結(jié)合，從而顯示出兩種抗原在組織切片的定位。此法的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記物所顯示出的組織抗原的部位經(jīng)過兩次選擇，標(biāo)記了抗原只能與相應(yīng)的特異性抗體相結(jié)合而不能與切片中非特異性Ig相結(jié)合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時(shí)需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對(duì)不同抗原分別進(jìn)行標(biāo)記，非一般實(shí)驗(yàn)室所能做到，所以至今尚未被廣泛應(yīng)用。
雙面金標(biāo)記法操作程序（Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982).
�。�1)鎳網(wǎng)面A（樹脂包埋)
�、僬麴s水沖10min。
�、�10% H2O2蝕刻10min室溫
�、�10%正常血清（以0.5mol/l Tris緩沖液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀釋，簡稱TBT緩沖液)室溫30min。
�、芤詾V紙吸去多余液體，覆于特異性第一抗體1：500（Tris 緩沖液，pH7.4,含1%BSA和0.1%疊氮鈉)4℃，孵育過夜
�、輳氐浊逑�，應(yīng)用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.2,不含BSA
�、蘩^之用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.6,含1%BSA沖洗
�、�0.5mol/L Tris緩沖液pH8.2,含1%BSA，室溫孵15min
�、嘌蚩雇肐gG標(biāo)記以15nm金粒，應(yīng)用0.5mol/l Tris緩沖液pH8.2、含1%BSA稀釋1：40，孵育2h，室溫
�、�0.5mol/L Tris緩沖液pH7.4 沖洗
⑩蒸餾水沖洗
�。�2)鎳網(wǎng)面B，重復(fù)①～⑩，只在第④時(shí)更改另一特異性一抗，在⑧時(shí)羊抗兔IgG標(biāo)記以5nm金粒。
�。�3)鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒標(biāo)記。
注意事項(xiàng)：①所有溶液均須經(jīng)加有微孔濾紙（0.45μm孔，國內(nèi)外現(xiàn)均有商品提供)的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。②濾紙最好用無纖維吸水濾紙。③沖洗在膠金標(biāo)記技術(shù)上是個(gè)決定性關(guān)鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會(huì)是一般應(yīng)漂洗3×5min，以注射器噴水漂洗效果優(yōu)于杯漂洗法，但漂洗水流需與網(wǎng)面平行，勿使水壓破壞切片。
