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摘要　目的：在老年性癡呆的發(fā)病中，年齡是最主要的危險因素，隨年齡增長，發(fā)病率顯著增高，自然衰老大鼠模型是比較接近老年性癡呆病理改變的動物模型。我們以往的實驗證明：中藥復方962膠囊(含何首烏、石葛蒲等六味中藥)能顯著改善老年大鼠學習記憶功能。本研究觀察中藥復方962膠囊對自然衰老大鼠模型海馬CAI—CA4區(qū)神經生長因子(NGF)及其受體TrK A表達的影響，探討中藥復方962膠囊治療改善學習記憶功能的作用機理。方法：雌性Wistar大鼠老年為22月齡，青年為5月齡。陽性對照藥為腦復康(piracetam)0.56g/kg，中藥復方962膠套高劑量1.8g／kg，962膠囊低劑量0.9g／kg，每日灌胃給藥一次，連續(xù)灌胃2個月，進行學習記憶實驗(水迷宮)和曠場分析后，每組隨機選取5只，灌注固定，冰凍切片，片厚40μm，每份標本均ABC法行NGF和TrK A免疫組化染色。采用法國Noesis Vision公司VISILOG5.0圖象分析系統(tǒng)對組織切片進行分析。顯微鏡放大倍數為10×10，在海馬CAl區(qū)錐體細胞層連續(xù)攝取3個視野，這三個視野包括了整個CAl區(qū)，記數3個視野內總陽性細胞數量、陽性細胞總面積(象素單位)及陽性細胞灰度積分值(灰度單位)。海馬CA2區(qū)連續(xù)攝取2個視野，海馬CA3區(qū)連續(xù)攝取2個視野，海馬CA4區(qū)攝取齒狀回包含的1個視野，包括了整個CA2、CA3、CA4區(qū)。數據用均數±標準差表示(M±SD)，結果采用t檢驗。結果：①老年大鼠海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)NGF表達較青年對照明顯減少，陽性細胞數量為青年對照的19.89％，11.46％，6.65％和26.32％；陽性細胞總面積為青年對照的13.97％，6.76％，5.19％和25.01％；陽性細胞灰度積分值為青年對照的41.05％，35.49％，16，74％和29.17％。海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)神經生長因子受體Trk A表達較青年對照也明顯減少，陽性細胞數量為青年對照的12.42％，7.07％，9.26％和29.33％；陽性細胞總面積為青年對照的7.61％，4.92％，5.62％和23.79％；陽性細胞灰度積分值為青年對照的29，30％，18.70％，17.51％和34.19％。以CA2、CA3區(qū)的減少最嚴重。⑦中藥復方962膠囊和腦復康均能提高老年大鼠海馬CAl一CA4區(qū)NGF和Trk A陽性細胞數量、陽性細胞總面積和陽性細胞灰度積分值，962膠囊高劑量組基本恢復青年對照組水平。結論：老年大鼠神經生長因子(NGF)及其受體Trk A在海馬區(qū)表達明顯減少，可能與其學習記憶能力下降有關；中藥復方962膠囊能夠明顯促進老年大鼠海馬區(qū)NGF及受體TrK A表達，可能是改善其學習記憶功能的藥理學基礎。增強內源性神經營養(yǎng)物質的表達對老年性疾呆的治療有重要意義。
關鍵詞　中藥　老年　大鼠神經生長因子　TrK A受體

　　老年性疾呆(Alzheimer’s disease。AD)是一種老年神經退行性疾病，臨床以進行性記憶障礙和后天獲得性知識喪失為特征，原因不明，尚元有效的治療方法。自然衰老大鼠模型是比較接近老年性癡呆病理改變的動物模型。我們以往的實驗證明：我室自行組方并研制的新復方962膠囊(含何首烏、石葛蒲等六味中藥)能顯著改善老年大鼠學習記憶功能。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)在調節(jié)神經元生長和存活方面起著重要作用，AD過程中神經元的丟失至少部分是由于神經營養(yǎng)因子的缺乏。本文觀察自然衰老大鼠腦內是否發(fā)生神經生長因子(NGF)及其受體Trk A表達的變化，以及962膠囊對內源性NGF及其受體Trk A表達的影響，探討962膠囊改善學習記憶功能的作用機理。

1 藥品：　中藥復方962膠囊，委托北京第四制藥廠加工提供，批號：980515，每克干粉含生藥量6.25克。實驗時采用水溶解，動物灌胃量10m1／kg。陽性對照藥品：腦復康 (piracetam)，由北京市曙光制藥廠提供，批號：970618，京衛(wèi)藥準字(1996)第138050號。實驗時用水溶解配成0.056g／m1。

2 動物：　Wistar大鼠雌性，老年大鼠為22月齡(體重330±32g)，青年為5月齡(體重325±19g)。購于北京醫(yī)科大學動物中心，動物證號：醫(yī)動字01—3056。

3 試劑與主要儀器：　ABC試劑盒、神經生長因子(NGF)兔抗鼠抗體、酪氨酸蛋白激酶受體A(Trk A，主要為NGF的受體)兔抗鼠抗體均購自北京中山試劑公司；恒溫冷凍切片機為英國山盾公司ASE—620型，光學顯微鏡為NikonTE300型，圖象分析系統(tǒng)為法國NoesisVision公司VISIUG5.0。

4 方法：
　　 (1)分組與給藥：分組情況見表1，每日灌胃給藥一次，灌胃2個月后，進行學習記憶實驗(水迷宮)和曠場分析，然后灌注固定，取材進行組織形態(tài)學實驗。

　表1 　大鼠分組給藥情況

分組	給藥	折合成人劑量的倍數
青年對照	水
老年模型	水
腦復康	腦復康(0.56g／kg)	7倍
962膠囊低劑量	962膠囊(0.9g／kg)	7倍
962膠囊高劑量	962膠囊(1.8g從g)	14倍

表2　 962膠囊對老年大鼠海馬CAl一CA4區(qū)神經生長因子(NGF)表達的影響

NGF

海馬區(qū)

青年對照

老年模型

腦復康

962膠囊

962膠囊

陽性細胞數量　　
　　

　　

(0．56B／k8)

(0．9B／k8)

(1，8B／k8)

CA1

119．8±76.3

23．8±12．4

74．0±59.2

78．6±47.7

132．1±69．6**

CA2

212．7±110，4**

24．4±25．8

134．1±55．9**

110．6±83．8*

147．5±64.1**

CA3

142．5±49.4***

9．5±7.5

112.O±56.4***

75．5±76.9*

l01．9±53.2**

CA4

38．6±22.6*

10．2±10．4

39．9±21.8*

36．3±28.3*

45.l±30.7*

Total

513．6±254．4**

67．8±27．8

360．1±177．0**

300．9±195．8

426．6±202.2*

陽性細胞總面積
(×10’
象素單位)

CA1

33．0±22．2*

4，6±3.4

18．1±14．5

25．2±18．0*

39．6±22.4**

CA2

80．4±48.5**

5．4±6.9

48．6±27.9**

44．5±37.9*

58．1±27.1**

CA3

47．1±21．4***

2．4土2．2

33.5±20．8**

28．1±34，3

32．5±10．7***

CA4

11．1±8．6*

2．8±3.3

8．0±4.6*

13．4±9．6*

14．0±11．8*

T0taI

171．7±90.7*

15．3±7．6

108．2±61.9**

111．2±81．8*

146．3±59.6***

陽性細胞灰度積分
值(×10’灰度單位)

CAl

35．4±15．0*

14．5±10．4

30．4±15．0

29．1±15，7

42．8±9.1**

CA2

47．4±14．8**

16．8±13．4

60．1±21.4**

37．2±21.0

58．0±17．8**

CA3

45．2±14．4***

7．6±7．0

61．3±4Q．4**

32．9±32.9

59．4±27.6**

CA4

26．2±16．3*

7．6±7.8

34．0±27.5*

22．7±19．5

35．8±32.4*

Totd

154．1±37．9***

46．5±22.3

185．8±91．5**

121．9±84．7*

196．0±75．3**

　n＝5，x±s，與老年模型組比較， * P＜0．05， ** P＜0．01， *** P＜0．001，

2 　中藥復方962膠囊對老年大鼠海馬CAl—CA4區(qū)神經生長因子受體Trk A表達的影響
　　結果見表3。老年大鼠模型組海馬CAl一CA4區(qū)神經生長因子受體TrkA陽性神經元顯著少于青年對照組，陽性細胞數量分別為青年對照的12.43％，7.07％，9.26％和29，33％5陽性細胞總面積為青年對照的7.61％，4，92％，5.62％和23.79％；陽性細胞灰度積分值為青年對照的29.30％，18.70％，17，51％和34，19％。962膠囊與腦復康有增加的作用。962膠囊大劑量組(1.8g／kg)促進老年大鼠海馬各區(qū)Trk A表達的作用最顯示，陽性細胞數量是末用藥模型照的4.1，9.6，8.2和2.6倍；陽性細胞總面積為模型組的6.1，12.8，14，3，3.5倍；附性細胞灰度積分值為模型組的2.2，4，9，5.4，1.1倍，962膠套對老年大鼠海馬CA2、CA3區(qū)T山A表達的增加作用最明顯。

表3 　962 膠囊對老年大鼠海馬CAl—CA4區(qū)Trk A表達的影響

NGF

海馬區(qū)

青年對照

老年模型

腦復康

962膠囊

962膠囊

陽性細胞

數量
　
　

　

(0.56g/kg)

(0.9g／kg)

(1.8g／kg)

CAl

163.9土139.6*

20.4±16.9

77.6±43.7*

67.1±52.1*

104.4±89.3*

CA2

205.9±147.0**

14.6±18.7

127.4±78.4**

102.4±108.7

154.8±93.3**

CA3

117.4±68.1**

10.9±5.4

51.5**

78.7±74.1*

99.8±55.1**

CA4

51.0±24.0**

15.0±10.7

47.6±26.0*

30.2±22.1

54.1±30.5*

Total

538.3±364.7**

60.8±39.6

343.2±183.7**

278.4±217.5*

413.1±255.4**

陽性細胞：
總面積(×
10³象
素單位)

CA1

77.9±59.0*

5.9±6.6

51.6±4.75*

24.6±16.1*

41.8±31。7*

CA2

l12.9±65.71**

5.6±9.9

70.9±42.8**

44.1±55.4

77.5±54.6**

CA3

56.o±34.3**

3.1±2.1

51.6±31.6**

31.9±39.3

47.3±21.6***

CA4

28.0±20.0

6.7±6.2

22.5±11.2*

12.7±16.0

30.2±22.6

Total

274.8±161.5**

21.3±18.7

196.6±115.4**

113.3±102.2*

196.8±113.7**

陽性細胞
灰度積分值
(×l0²
灰度單位)

CA1

41.5±26.8*

12.2±10.6

28.6±12.2*

25.4±26.3

38.7±26.5

CA2

45.8±7.2***

8.6±8.3

43.5±30.9*

39.4±30.2*

51.0±29.3**

CA3

43.1±13.4***

7.5±4.9

43.1±30.5*

37.9±39.1

47.9±30.4**

CA4

28.3±19.2*

9.7±7.2

26.4±18.*

17.7±14.5

20.0±7.40

Total

158.6±35.3***

37.9±25.3

141.6±86.5*

120.3±108.1

157.6±91.2*

結論與討論

　　神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是最典型、研究最深入的神經營養(yǎng)因子之一，高水平存在于大腦皮層、海馬、嗅球等腦區(qū)，主要作用于膽堿能神經元。Trk A受體是神經元細胞膜上NGF的高親和力受體，NGF與其結合后內在化，經逆行轉運至胞體、胞核，引發(fā)一系列生理反應，促進神經元增殖和分化，調節(jié)中樞和外周存活和軸突生長，并對效應神經元的化學、機械損傷修復起重要作用。NGF和Trk A缺失的小鼠表現(xiàn)大量背根節(jié)神經元與交感神經元的喪失以及膽堿能神經元功能缺失。有學者認為AD過程中神經元的丟失至少部分是由于一種或多種神經營養(yǎng)因子的缺乏(如NGF，BDNF，NT3)，這些神經營養(yǎng)因子的受體trkA，trkB，trkC在AD病人腦中分別下降的69％，47％和49％。嚙齒動物中，老齡Fischer—334大鼠海馬及前腦NGF mRNA水平下降40—50％。國內研究主要使用Wistar及SD大鼠，在衰老過程中NGF水平、壽命、學習能力及某些神經化學、神經形態(tài)學變化均與Fischer—334大鼠不同。但對這兩類老齡大鼠NGF水平顯著性變化目前尚無一致報道。我們的研究證明，老年雌性Wistar大鼠與學習記憶密切相關的海馬區(qū)錐體細胞層，神經元NGF及其受體TrkA表達(棕色物質)明顯降低。有報道老齡大鼠皮質注入標記的NGF，其逆向轉運明顯減少。不能逆向轉運的神經元呈現(xiàn)皺縮和萎縮，伴隔區(qū)TrkA mRNA減少。因此筆者認為，NGF逆向轉運障礙及NGF水平下降是老齡大鼠腦內起始改變，由此引起神經元的萎縮及受體TrkA減少，進一步降低了NGF的生理效應，最終導致膽堿能神經元的缺失和學習記憶障礙。這一病理過程可能與AD過程相類似。

　　海馬區(qū)根據細胞結構的不同分為CA1、CA2、CA3、CA4四個區(qū)域，它們都與學習記憶密切相關，但在功能上略有不同。CA2、CA3區(qū)是學習記憶的中心區(qū)，而CAl、CA4區(qū)是學習記憶的周邊區(qū)。我們的研究發(fā)現(xiàn)：老年大鼠海馬CAl、CA2、CA3、CA4區(qū)NGF表達均較青年對照明顯減少，但老年大鼠海馬CA2、幟3區(qū)NGF的表達減少更嚴重，與學習記憶的功能分區(qū)相一致是造成老年大鼠學習記憶障礙的主要原因。

　　側腦室內注射NGF可減少切斷隔海馬徑路或穹窿傘引起的膽堿能神經元退變，老齡大鼠注射NGF可提高膽堿乙�；D移酶的水平，改善認知及記憶功能，因此NGF治療AD有理論根據。文獻報道腦室內灌注NGF(1—3個月)治療AD病人3例，出現(xiàn)語言插曲記憶改善，額、顳皮層煙堿結合增加，腦血流增加，說明NGF的治療意義。然而，外源性NGF價格昂貴，分子量大不易通過血腦屏障，具有嚴重的副作用(包括體重減輕、疼痛和精神錯亂)，并不是理想的治療方法。因此增加內源性NGF的合成和釋放，成為研究AD治療的重要內容。

　　962膠囊是我室自行研制開發(fā)的中藥新藥，目前，已完成臨床前藥效及毒理研究。我們以往的實驗證明：962膠囊能顯著改善老年大鼠學習記憶功能。本實驗發(fā)現(xiàn)，在與學習記憶密切相關的海馬CAl—CA4區(qū)錐體細胞層，962膠囊能明顯促進自然衰老大鼠神經生長因子(NGF)及其受體(Trk A)表達，說明其可能含有或導致體內產生能通過血腦屏障的某些小分子物質，促進內源性NGF及其受體合成和釋放。962膠囊對學習記憶的中心區(qū)一海馬CA2、CA3區(qū)NGF和Trk A表達的增加作用最強，這一藥理基礎是其改善老年大鼠學習記憶功能的重要機制，對于保護和修復神經元，防治AD等神經退行性疾病具有重要意義。

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