膠質(zhì)瘤基因治療的進(jìn)展

關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 基因治療

　　膠質(zhì)瘤基因治療的實(shí)驗(yàn)研究始于80年代末。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入，惡性腫瘤的基因治療越來(lái)越受到重視，本文將膠質(zhì)瘤在突變補(bǔ)償、分子化療和遺傳性免疫增強(qiáng)三方面的研究情況加以綜述。

　　1　突變補(bǔ)償

　　目前對(duì)腫瘤的病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。突變補(bǔ)償就是消除激活的癌基因或增強(qiáng)抑癌基因的功能。

　　1.1　消除激活的癌基因　包括反義核酸、核酶和單鏈抗體技術(shù)。反義核酸是指與體內(nèi)某RNA或DNA序列具有互補(bǔ)順序，并能通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈雜交，從而影響其轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程的RNA或DNA片段。癌基因反義核酸的導(dǎo)入，抑制了癌基因編碼蛋白質(zhì)的合成，從而抑制癌基因的功能。膠質(zhì)瘤常過(guò)表達(dá)一些生長(zhǎng)因子。TGF-β是一種T細(xì)胞抑制因子，用反義TGF-β表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)9L膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞，可使荷瘤鼠長(zhǎng)期生存率達(dá)100％，12周后腫瘤消失，淋巴結(jié)效應(yīng)細(xì)胞增加了3～4倍［1］。VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂，把VEGF／VEGFR的通路打斷，可抑制腫瘤血管的形成。Saleh等［2］把C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞用反義VEGF的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，VEGF的表達(dá)水平下降，組織學(xué)檢查見腫瘤內(nèi)血管數(shù)目減少且有很大程度的壞死。肽生長(zhǎng)因子bFGF對(duì)膠質(zhì)瘤的增殖、浸潤(rùn)有刺激作用。反義bFGF使U-87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖被抑制70％［3］。Trogan等［4］發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤有IGF-1異常表達(dá)，此表達(dá)異�？纱龠M(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；反義IGF-1的導(dǎo)入，成功治療了轉(zhuǎn)基因鼠的腦內(nèi)膠質(zhì)瘤。

　　雖然反義核酸治療惡性腫瘤有一定效果，但也有局限性，不能轉(zhuǎn)運(yùn)足夠的反義核酸到靶細(xì)胞而達(dá)到長(zhǎng)期逆轉(zhuǎn)腫瘤的目的，現(xiàn)已設(shè)計(jì)了一種具有催化活性的反義RNA，又被稱為核酶（ribozyme），它不僅可與RNA結(jié)合，同時(shí)還能使其裂解，可反復(fù)使用。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）表達(dá)CD44粘附分子，設(shè)計(jì)了兩種錘頭核酶（ham merhead ribozymes）來(lái)抑制CD44的表達(dá)。兩種核酶定靶于CD44的外顯子2上，對(duì)轉(zhuǎn)錄的CD44S、CD44R1RNA進(jìn)行剪切，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)顯示了其對(duì)CD44轉(zhuǎn)錄的裂解作用，這樣降低了CD44的表達(dá)［5］。

　　單鏈抗體技術(shù)是利用抗體的特異性和高親合特征，對(duì)表達(dá)抗體的基因進(jìn)行操作，使其在抗原結(jié)合區(qū)表達(dá)，又被稱為內(nèi)抗體（intrabody）。erbB2在許多腫瘤，特別是一些腺癌中過(guò)表達(dá)，將erbB2單鏈可變區(qū)抗體（scFV）基因?qū)�入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可抑制erbB2跨膜蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)，引起明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制［6］。這種“敲除”（knockout）癌基因的方法很有效，也很有前途，但這方面報(bào)道較少。

　　1.2　增強(qiáng)抑癌基因的功能　P53是普遍公認(rèn)的抑癌基因，是一種多功能蛋白質(zhì)。它可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，監(jiān)控細(xì)胞周期，激活細(xì)胞凋亡，控制DNA的復(fù)制與修復(fù)，也發(fā)揮著保持基因組穩(wěn)定的作用。許多腫瘤都發(fā)生P53的點(diǎn)突變，突變使P53抑癌功能喪失，而獲得了腫瘤的形成能力。Frankel等［7］報(bào)道，在40例膠質(zhì)瘤中有16例（40％）發(fā)生了P53突變。Badie等［8］用AdP53轉(zhuǎn)染9L細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)、外試驗(yàn)，PCR和Westennblot證實(shí)了P53的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，使腫瘤體積縮小。Morita等［9］對(duì)521例多形膠母細(xì)胞瘤病人進(jìn)行回顧性分析，其中10例生存期≥7年，這10例中有4例P53過(guò)表達(dá)，表明GBM病人的長(zhǎng)期生存可能與P53的過(guò)表達(dá)有一定的關(guān)系。

　　新近又發(fā)現(xiàn)一種抑癌基因P21WAF1／CIP1，為野生型P53激活片段，也是周期依賴激酶的抑制劑。用AdP21WAF1／CIP1轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，可抑制其增殖和腫瘤形成。P16（CDKN2／MTS1）是一種具有許多特性的腫瘤抑制基因，在膠質(zhì)瘤中缺失率高達(dá)50％。Fueyo等［10］用Ad5RSV-16將P16基因?qū)�入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可直接合成功能性的P16，明顯抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，改善了被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的惡性表型。

　　2　分子化療

　　該方法是將毒素基因釋放到腫瘤細(xì)胞而達(dá)到化療“輻射”的作用。在這方面研究最多、最深入的是HSV-TK／GCV系統(tǒng)。HSV-TK基因表達(dá)產(chǎn)物可使對(duì)哺乳細(xì)胞無(wú)毒或低毒的核苷類似物（GCV或ACV）轉(zhuǎn)換成毒性的GCV-TP，抑制DNA多聚酶并摻入到DNA鏈中，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。有關(guān)這方面報(bào)道較多，大多是采用產(chǎn)生HSV-TK的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞，GCV治療后，發(fā)現(xiàn)腫瘤完全消退。也有對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)動(dòng)力學(xué)和毒性進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對(duì)小鼠、大鼠和猴基本是安全的；也未檢測(cè)到插入突變和有復(fù)制能力病毒的產(chǎn)生。膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)，易被自殺基因TK轉(zhuǎn)導(dǎo)。但也存在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)TK基因?qū)е陆M織損傷的可能性，如腸上皮和骨髓細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起腹瀉和骨髓抑制，為此，研究者們克隆了只在特異組織表達(dá)的啟動(dòng)子基因，用MBP啟動(dòng)子與HSV-TK結(jié)合就可只轉(zhuǎn)導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，GCV治療后使腫瘤消退，避免了腹瀉和骨髓抑制等副作用［11］。

對(duì)HSV-TK基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)開始多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒，近幾年開始嘗試用其它載體，如單純皰疹病毒本身，腺病毒及質(zhì)粒DNA的直接注射等，對(duì)單純皰疹病毒進(jìn)行操作，保留其TK基因，去除那些編碼神經(jīng)毒性的基因如RR（核糖核酸還原酶）基因，成為單純皰疹病毒的突變體hrR3，用此載體結(jié)合GCV治療膠質(zhì)瘤很有效［12］。腺病毒以其極高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及安全性備受青睞。Maron［13］用腺病毒把HSV-TK導(dǎo)入C6膠質(zhì)瘤中，GCV治療后，腫瘤體積縮小28倍，生存期延長(zhǎng)了4倍。也有學(xué)者把含有HSV-TK的質(zhì)粒直接注射來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種質(zhì)粒表達(dá)載體較安全，易構(gòu)建。也可應(yīng)用較強(qiáng)的啟動(dòng)子和脂質(zhì)體包裹提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá)時(shí)間。HSV-TK／GCV是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于人惡性膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)的基因治療系統(tǒng)。Oldfield［14］報(bào)道7例接受HSV-TK／GCV治療的病人，其中5例腫瘤縮小，臨床效果和安全性都較好。其它研究機(jī)構(gòu)有關(guān)這方面的報(bào)道尚少，總之仍處于實(shí)驗(yàn)階段。

　　3　遺傳性免疫增強(qiáng)法

　　本策略是通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)而獲得有效的抗腫瘤效應(yīng)�？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞因子、導(dǎo)入腫瘤相關(guān)抗原和其刺激分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞因子是調(diào)控免疫反應(yīng)所必需的。把細(xì)胞因子導(dǎo)入腫瘤、抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞（LAK，CTL，TIL）或易于移植和在體內(nèi)長(zhǎng)期存活的載體細(xì)胞，使在腫瘤局部分泌高濃度的細(xì)胞因子，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。目前已報(bào)道用于膠質(zhì)瘤基因治療的細(xì)胞因子很多，有IFN-γ、IFN-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、M-CSF等。Wei［15］和Nam［16］分別用NIH3T3和內(nèi)皮細(xì)胞把IL-4和IL-2導(dǎo)入C6和9L腫瘤內(nèi)，可見腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑，荷瘤鼠生存期延長(zhǎng)。組織化學(xué)檢測(cè)在注射部位有小膠質(zhì)細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、CD8＋NK細(xì)胞的浸潤(rùn)。Sobol等［17］報(bào)道了1例星形細(xì)胞瘤病人，用自體腫瘤細(xì)胞混合IL-2基因修飾的成纖維細(xì)胞，分10次皮下注射，病人細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，治療4周后，腫痛有明顯的壞死。但是，由于細(xì)胞因子生物學(xué)作用多樣性，其與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，加上細(xì)胞因子在體內(nèi)處于一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（Cytokinenet-work）之中，并受到整體調(diào)節(jié)，如何在體內(nèi)充分發(fā)揮其治療作用仍需進(jìn)一步研究。

　　腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)，這是由于腫瘤細(xì)胞免疫原性比較差，不足以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng)。導(dǎo)入腫瘤相關(guān)抗原，提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。Asai［18］把s-myc基因與巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)C6、9L膠質(zhì)瘤，抑制了腫瘤的形成。這是由于s-myc的表達(dá)刺激C6、9L腫瘤相關(guān)抗原提呈給T-淋巴細(xì)胞，激活了宿主的免疫反應(yīng)。缺陷型單純病毒Ⅰ型（dlsptk）治療膠質(zhì)瘤有效，部分是由于病毒的感染，腫瘤細(xì)胞表面產(chǎn)生新抗原而誘發(fā)的免疫反應(yīng)所致。B7是激活CTL細(xì)胞的第二個(gè)信號(hào)，B7分子的導(dǎo)入可激活CD8＋CTL細(xì)胞，引起腫瘤消退。Yang等［19］把B7·2cDNA用質(zhì)粒導(dǎo)入P815細(xì)胞中，引起P815腫瘤的消退，而且對(duì)P815的再次攻擊產(chǎn)生抵抗。Zitvogel［20］把IL-12和B7·1共同導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，抗腫瘤效應(yīng)更明顯。這種聯(lián)合應(yīng)用兩種或多種方法可能成為今后治療腫瘤的一個(gè)方向。

　　目前進(jìn)行膠質(zhì)瘤基因治療的方法和策略很多，但都處于實(shí)驗(yàn)階段。幾種用于人腫瘤基因治療的方法中，療效滿意的并不多�；�因治療的發(fā)展受限于分子生物學(xué)技術(shù)和腫瘤病因?qū)W的研究進(jìn)展，根據(jù)腫瘤是一種多基因遺傳病的理論推測(cè)，隨著膠質(zhì)瘤所涉及惡性轉(zhuǎn)化的所有異常基因表達(dá)的闡明，這種針對(duì)腫瘤發(fā)生的基因治療，一定會(huì)有美好前景。