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關(guān)鍵詞： 分支桿菌 結(jié)核；katG；基因表達；蛋白純化
【摘要】目的 表達與純化結(jié)核分支桿菌katG蛋白，為深入研究異煙肼耐藥機制奠定基礎(chǔ)。方法 將含有katG基因的pET24b-katG表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 菌株，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)下表達，分別對不同誘導(dǎo)時間的表達產(chǎn) 物進行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染 色。獲得穩(wěn)定的高表達菌株后采用Xpress TM蛋白純化系統(tǒng)對超聲破菌液進行純 化。最后對純化產(chǎn)物進行過氧化氫酶活性的初步檢測。結(jié)果 對誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌菌液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)以及考馬斯亮藍染色后 發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量約為80 000。表達蛋白量約占總蛋白量的17.7%。對重組katG基因表達產(chǎn) 物進行 純化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以350 mmol/L咪唑洗脫時的純化效果最理想，蛋白純度可達90%以上。對 表達產(chǎn)物進行過氧化氫酶活性初步檢測證明，重組的katG基因產(chǎn)物具有過氧化氫酶活性。[ HTH〗結(jié)論 通過pET24b-katG表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得基因重組的katG高表 達菌株，表達產(chǎn)物具有一定酶活性，經(jīng)純化后可達到較高的純度。
Overexpression and purification of catalase-peroxidase katG from mycobacterium tuberculosis
【Abstract】Objective To express and purify the catala se-peroxidase katG gene from mycobacterium tuberculosis. Methods Plasmid pET24b containing katG was transferred into com petent Escherichia coli and katG gene was overexpressed by the challenge of isopropylthio-β-D-glactoside(IPTG). The expression of katG protein was on e-step purified by Xpress systemTM. Furthermore, the catalase activity of katG protein was preliminarily detec ted. Results The recombinant escherichia coli produced katG p rotein in large quantities, accounting for 17.7% of total cell protein. The mole cular mass of katG protein was estimated to be 80 000 by sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gradient gel electrophresis (SDS-PAGE). It was found that imidazole at the concentration of 350 mmol/L could elute the katG protein most efficiently and yield the final preparation at greater than 90% purity. Th e katG protein was preliminarily detected to have the activity of catalase. Conclusions The stable katG overexpressing recombinant Escherichi a coli can be constructed by the plasmid pET24b containing katG gene. The reco mbinant strain can produce katG protein with catalase activity and the product o f which can be purified into higher activity.
【Key words】Mycobacterium tuberculosis; katG ; Gene expression; Protein purification
異煙肼(INH)是一種最經(jīng)濟有效的抗癆藥，幾乎所有的抗癆方案中均包括IN H。結(jié)核分支桿菌編碼的katG基因的突變可致結(jié)核分支桿菌對INH 產(chǎn)生耐藥性［1］。自1992年以來，對于katG基因變異或缺失造成分支桿菌對異煙肼 耐藥的基因水平研究已較為深入［1，2］，有必要在蛋白水平對耐藥機制進行進一步 研究。本研究將含有katG基因的pET24b-katG表達載體轉(zhuǎn)化埃希大腸桿菌BL21(DE3)菌株 ，獲得穩(wěn)定的高表達菌株后進一步對表達產(chǎn)物進行了純化，并對純化產(chǎn)物進行了酶活性的初 步檢測。
材料與方法
一、材料
(一) 質(zhì)粒與菌株 表達質(zhì)粒pET24b-katG與埃希大腸桿菌BL21(DE3)由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究 所惠贈。
(二) 試劑 XpressTM蛋白純化系統(tǒng)為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；異丙基-β-D硫代 半乳糖苷(IPTG)為華美生物工程公司產(chǎn)品；其他主要生化試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品或國內(nèi)A R級產(chǎn)品。
二、方法
(一) 表達載體的轉(zhuǎn)化與基因產(chǎn)物的表達 將表達質(zhì)粒pET24b-katG轉(zhuǎn)化用氯化鈣處理法得 到的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株，將菌株涂于含卡那霉素的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)。 挑取抗卡那霉素的菌株接種于20 ml的LB培養(yǎng)基(加入20%的葡萄糖0.2 ml，濃度50 mg/ml的 卡那霉素40 μl,濃度20 mg/ml的氯霉素34 μl)中，37°C，160 r/min振搖過夜。取3 ml過 夜培養(yǎng)物種入100 ml的LB培養(yǎng)基(含20%的葡萄糖1 ml，濃度10 mg/ml的卡那霉素400 μ l， 濃度20 mg/ml的氯霉素170 μl)中，37°C以160 r/min振搖，每20 min測定1次A60 0值，直至A600值到達0.4～0.5(勿超過0.5)。隨后每100 ml LB培養(yǎng)基中 加入1 mol/L IPTG 400 μl，分別在加入IPTG后的第2、3、4、5、6 h收集菌液。將菌液在4 °C下，5 000 g，離心5 min，棄上清。將沉淀物以10 ml緩沖液(50 mmol/L Tris.Cl, pH 8 .0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% Triton X-100)重新懸浮，加入溶菌酶(100 μg/ml)。在冰浴中以中等強度超 聲破菌，每次10 s，共3次，破菌后，4°C， 離心5 min，收集上清液備用。
(二) 表達產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測 參照文獻［3］ 進行。收集IPTG誘導(dǎo)后的菌液10 μl，與 加樣液10 μl混合，100°C水浴，3 min后點樣，25 mA恒流通電進行SDS-PAGE。電泳后以 考馬斯亮藍染色15 min，然后以脫色液脫色觀察結(jié)果。
(三) 表達產(chǎn)物的純化 采用Xpress TM蛋白純化系統(tǒng)進行純化。用無菌雙蒸水懸 浮樹 脂純化柱3次。加入7 ml結(jié)合液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 7.8)，以及經(jīng)IP TG不同時間誘導(dǎo)后產(chǎn)量最高的破菌液上清5 ml，重新懸浮純化柱。反復(fù)輕搖混合2 min。靜 置10 min，吸棄上清，再加入破菌液上清5 ml重復(fù)以上步驟。以4 ml結(jié)合液重新懸浮純 化柱 ，溫和搖動混合2 min，靜置沉淀，吸棄上清，共3次。再以沖洗緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉， 500 mmol/L氯化鈉，pH 6.0)洗4次，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、200、350、500 mmo l/L)各5 ml加入柱中，收集不同洗脫濃度的洗脫液。將洗脫液進行SDS-PAGE。將純化后的 蛋白以85%的硫酸胺沉淀，離心后將沉淀物以無菌雙蒸水溶解，4°C透析過夜。透析產(chǎn)物加 入甘油(40%)后貯藏于-80°C的環(huán)境下。
(四) 過氧化氫酶活性測定 對破菌液上清進行過氧化氫酶活性的初步測定。用磷酸鹽(K2 HPO4+KH2PO4,0.1 mol/L)與NaCl(2 mol/L)的緩沖液配制10%的Tween 80溶液，取 5 ml 與30%的雙氧水5 ml混合。分對照管與katG管，在katG管內(nèi)加入不同容積的含pET-katG表達 質(zhì)粒的菌株破菌上清(20、40、80、160 μl)，對照管 則加入含pET空載體的菌株破菌上清，10 min后觀察氣泡產(chǎn)生情況。如產(chǎn)生大量氣泡則提示 酶活性較佳。
結(jié) 果
一、重組katG蛋白的誘導(dǎo)表達以及產(chǎn)物的鑒定分析
將含有katG基因的pET24b-katG表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達，分別對不同誘 導(dǎo)時間的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色，可在相對分子質(zhì)量80 000處見一誘 導(dǎo)表達帶 (圖1)。比較不同誘導(dǎo)時間的表達產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)2 h后的表達產(chǎn)量已達到峰值。在其 后蛋白純化中即可選取該誘導(dǎo)時間的產(chǎn)物。對此誘導(dǎo)表達帶進行黑度密度自動掃描分析，此 處表達蛋白量約占總菌體蛋白量的17.7%。
二、重組katG基因表達產(chǎn)物的純化結(jié)果
采用Xpress TM蛋白純化系統(tǒng)進行純化發(fā)現(xiàn)，分別以不同濃度的咪唑洗脫液(50、 200、350、500 mmol/L)洗脫純化柱后，所收集的洗脫液再次進行SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ，以350 mmol/L咪唑洗脫后純化的效率最高，通過SDS-PAGE黑度密度自動掃描分析可以發(fā) 現(xiàn)純化率可達90%以上。
三、對katG基因表達產(chǎn)物的過氧化氫酶活性測定結(jié)果
在過氧化氫反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同容積的破菌上清(20、40、80、160、320 μl)，比較氣泡產(chǎn) 生情況，發(fā)現(xiàn)加入含pET-katG表達質(zhì)粒的菌株破菌上清的各管均有氣泡產(chǎn)生，且均較對照 管為明顯，而以加入量為160 μl與320 μl的反應(yīng)管產(chǎn)生氣泡最為顯著。提示重組katG表達 產(chǎn)物具有過氧化氫酶活性。
討 論
結(jié)核分支桿菌的katG在INH的抗結(jié)核作用機制中起著關(guān)鍵作用。研究表明INH實際上是一個 藥物前體，需經(jīng)結(jié)核分支桿菌過氧化氫酶-過氧化物酶活化后 才發(fā)揮抗結(jié)核作用，而katG則由katG基因所編碼［4］。有研究 通過質(zhì)粒將katG基因轉(zhuǎn)移到INH耐藥菌株胞內(nèi)，可令其對INH重新恢復(fù)敏感性。而對結(jié)核分支 桿菌的臨床耐異煙肼菌株進行katG基因分析亦發(fā)現(xiàn)該基因的缺失或突變是引起耐藥的主要原 因［5］。然而對于katG如何活化INH以及katG發(fā)生變異后導(dǎo)致耐藥的 確切機制仍然 不清，特別是近年來對于不同突變位點變異對藥物敏感性的影響程度頗有爭議［6］ ，因此在蛋白水平研究katG的作用環(huán)節(jié)與耐藥機制，以及比較不同位點 基因突變對酶結(jié)構(gòu)與活性的影響等方面進行研究可深入了解INH耐藥的發(fā)生機制，進而可 能在蛋白水平找到消除耐藥的途徑。由于結(jié)核分支桿菌生長較緩，而且具有較強的傳染性， 長期以來在提取結(jié)核分支桿菌蛋白進行研究的進展較緩。本研究通過基因重組的katG表達載 體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后產(chǎn)生高表達的katG蛋白，相對分子質(zhì)量約為80 000，表達量可占總菌體 蛋白的17.7%。表明該基因重組的菌株為katG的高表達菌株，對表達產(chǎn)物進行初步過氧化氫 酶活性研究驗證了其酶活性。進一步對表達產(chǎn)物進行純化后可提取到純度超過90%的katG蛋 白。本研究為進一步研究katG蛋白、katG對異煙肼的活化機制以及為檢測katG變異耐藥菌株 奠定基礎(chǔ)，并且對深入闡明INH的耐藥產(chǎn)生機制與尋求消除耐藥的方法有較大的意義。
參考文獻
1，Rouse DA, Li Z, Bai GH, et al. Characterization of the KatG a nd inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuber culosis. Antimicrob agents Chemother, 1995， 39:2472-2477.
2，Zhang Y, Heym B, Allen B, et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 1992, 358:591-593.
3，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T，著. 分子克隆實驗指南.金冬雁，黎孟楓，譯. 第2版. 北京：科學(xué)出版社，1992.
4，Telenti A, Honore N, Bernasconi C, et al. Genotypic assessment of isoniazid a nd rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at refer ence laboratory level. J Clin Microbiol, 1997, 35:719-723.
5，Stoeckle MY, Guan L, Riegler N, et al. Catalase-peroxidase gene sequences in isoniazid-sensitive and resisitant stains of，M.tuberculosis from New York City. JID, 1993,168:1063.
6，Rouse DA, DeVito JA, Li Z, et al. Site-directed mutagenesis of the K atG gene of mycobarterium tuberculosis: effects on catalase-peroxidase activite s and isoniazid resistance. Mol Microbiol. 1996, 22:583-592.
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