中國幽門螺桿菌研究:用PCR-SSCP 區(qū)分不同來源的幽門螺桿菌

幽門螺桿菌（Hp)感染在人群中廣泛存在，Hp的分型鑒定對其感染的臨床及流行病學研究具有重要意義。國外文獻報道的幾種基因型技術使Hp的分型鑒定成為可能，而PCR及單鏈構象多態(tài)性（Signle-strand conformationpolymorphisms,SSCP)分析在菌株分型鑒定中的應用則尚未見報道。作者采用PCR-SSCP分析區(qū)分不同來源的Hp，并探討其應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 Hp標準菌株NCTC11637，NCTC11848來自英國倫敦國家標準培養(yǎng)物收藏中心，由本院傳染科保存并提供；112株臨床分離鑒定的Hp來自97名因上胃腸癥狀在本院行胃鏡檢查的病人，經內鏡及病理診斷證實十二指腸潰瘍49例，胃潰瘍5例，慢性胃炎43例。所有病人在內鏡直視下于胃竇取粘膜活組織一塊做細菌培養(yǎng)，其中包括1例未經治療相融8個月復查胃鏡者，4名病人還另于胃底或十二指腸球部取粘膜活組織一塊做細菌培養(yǎng)，10例十二指腸潰瘍伴Hp感染者于抗生素治療停藥4周復查胃鏡，取胃竇粘膜活組織兩塊分別做細菌培養(yǎng)及PCR方法直接檢測Hp。

1.2 模板DNA的準備培養(yǎng)細菌或研碎的活檢胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k，55°C消化1h，以等體積苯本分氯仿-異戊醇（25:24:1)抽提，12000rpm離心10，吸取上層水相，加2.5倍體積冷無水乙醇12，000rpm離心10min沉淀DNA，以100μl無離子溶解DNA，1μl用于PCR擴增。

1.3 PCR擴增Hp基因組 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已證實對HpDNA特異，擴增片段長度為203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mMMgcl2,0.01%明膠，各200μdNTP，各0.5μMCAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA聚合酶（中科院遺傳所產品)。反應條件：94°C5min,1個循環(huán)；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35個循環(huán)；72°C10min，1個循環(huán)。以HpNCTC11637DNA為陽性對照，去離子水做陰性對照。

1.4 PCR產物的SSCP分析 PCR產物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C變性10min,加3μl電泳加樣緩沖液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯腈藍)混勻，于7.5%聚丙烯酰胺膠室溫電泳300V，3.5min，以0.19%硝酸銀染色30min，經顯色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化鈉)顯色后觀察結果，比較不同Hp菌株兩條單鏈DNA片段的遷移情況。

2 結果

2.1 PCR-SSCP方法的重復性 相隔半年轉種得到5對Hp菌株，每對菌株203bpPCR產物的SSCP分析均顯示完全相同的單鏈構象；同一菌株203bp PCR產物在不同聚丙烯酰胺膠上都呈現(xiàn)相同的單鏈構象，使不同凝膠上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。

2.2 Hp基因組DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段變性后的兩條單鏈，在中性聚丙烯酰胺膠中電泳的遷移率不同，從而形成不同的單鏈構象。來自97名病人的分離菌株及2株標準菌株產生7種不同的單鏈構象。通過比較不同的單鏈構象。通過比較不同Hp菌株的單鏈構象，將這97名病人的菌株分成6組（見表1)。同一病人相隔8個月分離培養(yǎng)的菌株，其203bpPCR產物的單鏈構象穩(wěn)定不變；4個病人不同培養(yǎng)部位的4對Hp菌株分別具有相同的單鏈構象。

表1 Hp標準菌株來自97名病人的臨床分離菌株的分組情況

2.3 治療前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治療后停藥1月或1月以上復查，發(fā)現(xiàn)6例細菌培養(yǎng)仍為陽性，4例細菌培養(yǎng)陰性而PCR檢測仍為陽性。對這10例病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)9例病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構象，1例病人治療前后的單鏈構象不同。對其中2例治療后僅PCR為陽性的患者，于停藥5個月～6個月復查時發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)轉為陽性，并與治療前菌株具有相同的單鏈構象（表2)

表2 10例Hp感染者治療前后菌株的PCR-SSCP分析

**B-治療前菌株；A-治療后菌株；a-治療后僅PCR陽性

表2中同時列出不同組別菌株的疾病來源，未發(fā)現(xiàn)不同組別的菌株與某一疾病有確定的關系，未發(fā)現(xiàn)與十二指腸潰瘍或胃潰瘍密切相關的Hp菌株。

3 討論

不同Hp菌株DNA分子具有多態(tài)性，PCR-SSCP分析作為檢測DNA多態(tài)及基因突變的方法，有可能檢出這一多態(tài)性，從而區(qū)分不同來源的Hp菌株。本研究用PCR-SSCP分析鑒別不同Hp菌株方法簡單、可靠、重復性好，通過比較97名病人的臨床分離菌株及2株標準菌株基因組DNA203bp片段的兩條單鏈DNA，在聚丙烯酰胺膠中的電泳遷移率，將這些被檢菌株分成7組，表現(xiàn)出中等度的分辨力。它雖然不能將所有不同病人來源的菌株逐一區(qū)分，但可對流行病學上某特定人群的菌株分組從而可以比較不同人群中感染的Hp有無差異。

本研究中顯示74%的菌株具有相同的單鏈構象，推測可能是北京市區(qū)人群Hp感染的主要菌型。本結果還證實同一病人相隔8個月分離的菌株，其203bp片段的單鏈構象穩(wěn)定不變，這與文獻中報道的同一病人2年內連續(xù)分離的多株Hp，其染色體DNA酶切圖型保持不變的結果相似。對來自4名病人不同部位的4對Hp菌株的PCR-SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)同一病人有不同類型Hp菌株的混合感染。Petwett等m.gydjdsj.org.cn/yishi/用Southern印跡法對來自15個病人的胃竇、胃體及十二指腸球部的64株Hp核糖型分析，發(fā)現(xiàn)2個病人分別感染了兩株不同的Hp。本文觀察的病人數(shù)不多，尚難做結論。

對10名病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)9名病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構象，認為是治療后同一菌株的復發(fā)。1名病人治療前后的菌株單鏈構象不同，可能是治療后獲得了新菌株的再感染，或藥物治療導致原來感染的菌株變異但也不排除兩株不同類型Hp菌株混合感染的可能。PCR-SSCP分析用于治療后Hp復發(fā)和再感染的鑒別與文獻報道相類似，但由于不同Hp菌株也可有相同的SSCP圖型，使該方法對治療前后菌株的鑒定不夠精確，進一步研究可通過選擇擴增DNA多態(tài)性更為顯著的片段，或許可以對治療前后菌株復發(fā)及再感染做出更精確的判斷。PCR-SSCP方法用于治療前后菌株的鑒定，可以從活檢胃粘膜中直接增出DNA片段用于SSCP分析，省卻了細菌培養(yǎng)的繁瑣耗時的過程，特別適用于那些治療后細菌培養(yǎng)無法檢出，而實際上仍然少量存在的Hp菌株的鑒定，這是其它菌相提并論鑒定方法難以達到的。研究表明，Hp存在著致病力不同的兩組菌株，它們致病力的不同表現(xiàn)在與不同的病癥的關系上。Tee等用Southern印跡法對Hp核糖帶型的研究，未發(fā)現(xiàn)Hp的核糖型或核糖型的某條帶與臨床疾病有對應關系、Yoshimara等用DNA-DNA雜交技術證實，十二指腸潰瘍和無癥狀胃炎病人感染的Hp有明顯的遺傳學差別。本研究對不同Hp菌株基因組DNA203bp片段的SSCP分析，未發(fā)現(xiàn)與臨床某一疾病相關的細菌DNA單鏈構象，可能由于該片段編碼的信息與Hp的致病力無關，對Hp毒素相關基因的分析或許可以發(fā)現(xiàn)與不同疾病表現(xiàn)相關的菌株，有待今后進一步研究。