中國幽門螺桿菌研究:抗幽門螺桿菌尿素酶抗體診斷試劑盒的研制與臨床應(yīng)用

本研究旨在制備純化的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化抗Hp尿素酶抗體試劑盒，供臨床ELISA檢測(cè)用。

1　材料與方法

1.1　試劑盒的制備

Hp尿素酶抗原的分離純化研制：①經(jīng)尿素酶試驗(yàn)選擇尿素酶活性高的經(jīng)系統(tǒng)鑒定的Hp菌株接種于含6％脫纖維綿羊血的布氏平皿中，置微氧環(huán)境，恒溫37℃培養(yǎng)3d收菌，脫洗、稀釋后超聲適度破裂，高速離心取上清液備用。②選用Sephadex G200柱（2.6×75cm柱型)在凝膠過濾成套設(shè)備中從Hp超聲破碎物離心上清液中一次提純Hp尿素酶。③將凝膠過濾后尿素活性峰與相應(yīng)菌全菌蛋白上柱液及離心沉渣SDS－PAGE分析，觀察尿素酶提純效果。④Western blot（免疫印漬)分析：經(jīng)SDS－PAGE將各蛋白分離后，經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，過渡、洗滌后，放入稀釋的兔抗Hp陽性血清（含抗高分子量菌體相關(guān)蛋白)中，震蕩、洗滌后，浸泡于稀釋后的辣根過氧化酶—葡萄球菌A蛋白液洗滌后將該膜放入新配制的底物顯色液中，震蕩，顯色，清洗，照相。

1.2　試劑盒的臨床應(yīng)用

研究對(duì)象：①病人：診斷按胃鏡及活檢病理確定。同期均檢測(cè)Hp抗體。第一階段用全菌抗原（抗Hp抗體)。男741例，女459例，年齡為18歲～77歲（42歲±10歲)。第二階段用商品化試劑盒Hp尿素酶抗原（抗Hp－u抗體)。男1015例，女660例，年齡為16歲～74歲（45歲±7歲)。兩組匹配情況相近。②獻(xiàn)血員：以上兩階段均有健康獻(xiàn)血員同期行Hp抗體檢查，各200例。胃鏡檢查及活檢取材：每例在距幽門5cm周徑內(nèi)的部位鉗取粘膜標(biāo)本分別送檢病理組織學(xué)檢查及Hp培養(yǎng)。組織學(xué)檢查：胃鏡活檢標(biāo)本HE染色組織學(xué)檢查，Giemsa染色確認(rèn)Hp存在。病理診斷參照全國胃癌防治研究協(xié)作組所訂標(biāo)準(zhǔn)。炎癥程度按正常、輕度、中度、重度分別判定為0、1、2、3級(jí)。細(xì)菌培養(yǎng)：送檢用的輸送培養(yǎng)基為10％小牛血清布氏肉湯培養(yǎng)基。每試管分裝3ml置入2塊胃鏡活檢組織塊。每例活檢鉗均經(jīng)消毒液浸泡15min后和酒精擦試。Hp培養(yǎng)基用布氏瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)為基礎(chǔ)，加入脫纖維羊血及聯(lián)合抗生素、3d后觀察結(jié)果，并作生化鑒定。

以上組織學(xué)與微生物學(xué)檢查結(jié)果獨(dú)立評(píng)價(jià)，不受臨床資料暗示影響。血清ELISA法測(cè)抗HpIgG和抗HpIgG。流行因素調(diào)查：制定統(tǒng)一調(diào)查表逐項(xiàng)登記。本組共連續(xù)調(diào)查了1200例。藥物治療：212例Hp陽性胃炎患者隨機(jī)分為3組。分別服諾氟沙星和膠體次枸櫞酸鉍（CBS，De—Nol)及安慰劑1個(gè)月。停藥1月后復(fù)查胃鏡及血清抗Hp抗體。

2　結(jié)果

2.1　Hp超聲破碎后

Hp超聲破碎后，高速離心，上清液可經(jīng)SephadexG200柱將Hp尿素酶有效分離。尿素酶活性與脫洗第一峰完全一致，而第一峰中經(jīng)SDS—PAGE檢測(cè)只含有30kD及66kD兩條蛋白帶。與Hp尿素酶兩個(gè)亞基的分子量一致，經(jīng)Western blot分析證明第一峰蛋白仍保持了很高的抗原性。

2.2　用提純的Hp尿素酶進(jìn)行血清抗Hp尿素酶抗體測(cè)定

用提純的Hp尿素酶進(jìn)行血清抗Hp尿素酶抗體測(cè)定，經(jīng)已確定的55份陽性血清標(biāo)本和50份陰性血清標(biāo)本對(duì)照檢測(cè)，符合率100％。無假陽性及假陰性。

2.3　對(duì)1675例進(jìn)行抗HpIgG抗體檢測(cè)

對(duì)1675例進(jìn)行抗HpIgG抗體檢測(cè)。若以培養(yǎng)及（或)組織染色為標(biāo)準(zhǔn)，則ELISA敏感性為98％，特異性96％，陽性預(yù)測(cè)值為98％，陰性預(yù)測(cè)值為96％�？笻pIgG抗體半定量結(jié)果，本組檢驗(yàn)以“++”為臨界值標(biāo)準(zhǔn)，敏感性可達(dá)98％，特異性達(dá)96％；若以“＋”為準(zhǔn)，則敏感性雖達(dá)99.1％，但特異性僅為84.9％。

2.4　各種商品試劑盒比較見表1。提示本組試劑盒檢測(cè)Hp感染敏感性和特異性均較高。

2.5　各種胃、十二指腸疾病患者血清抗HpIgG抗體檢測(cè)情況（見表1)。

2.6　流行因素調(diào)查

流行因素調(diào)查。 本組資料表明以下因素有意義：①Hp感染率隨年齡增長(zhǎng)遞增，至60歲達(dá)高峰。②本組肉聯(lián)廠工人（30例)與副食售貨員（菜、肉組)69例抗Hp抗體陽性率分別為90.0％和86.9％，高于其他工種（P＜0.01)。③飲食習(xí)慣：喜食涼拌生菜、肉食者Hp感染率高（P＜0.05)。④家庭成員中有胃十二指腸疾病者，較無此類病者Hp感染檢出率高（根據(jù)8個(gè)家庭、40名家庭成員統(tǒng)計(jì))。

2.7　ELISA血清Hp抗體檢測(cè)用于Hp陽性胃炎抗菌物治療后觀察抗體滴度下降（表2)。

表1　各種商品試劑盒比較

^a用乳膠凝集試驗(yàn)，余者ELISA測(cè)定。^b非商品化試劑盒

3　討論

本m.gydjdsj.org.cn/shiti/研究采用ELISA半定量檢測(cè)血清抗HpIgG，經(jīng)大宗病例臨床檢測(cè)應(yīng)用，敏感性、特異性高、批內(nèi)、批間差異小，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好。

表2　三組治療前后血清抗Hp滴度　　（x±s)

經(jīng)自身對(duì)照：^aP＞0.05，^bP＜0.01

臨床應(yīng)用觀察到，應(yīng)用本試劑盒，在慢性胃炎、消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良各類疾病中，抗HpIgG檢測(cè)陽性率均很高。尤其在慢性活動(dòng)性胃炎、十二指腸潰瘍中檢出率更高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Sobala強(qiáng)調(diào)血清學(xué)Hp抗體檢測(cè)可用于篩查消化不良，可減少23.3％病例用胃鏡檢查確立Hp感染。本研究也與之相符。

應(yīng)用血清Hp抗體為觀察指標(biāo)，來判斷用抗Hp藥物治療根除Hp效果，治療后抗體滴度下降或消失，與近幾年一些報(bào)道一致。本文認(rèn)為，用血清抗HpIgG追訪療效，也可減少患者接受胃鏡復(fù)查Hp根除與否之痛苦�？笻pIgG檢測(cè)用于流行病學(xué)研究無疑是一重要工具。