豬的冷凍精液技術(shù)研究進(jìn)展
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豬冷凍精液技術(shù)是指利用干冰（-79℃)、液氮霧等作冷卻源，將精液特殊處理后，保存在超低溫的液氮（-196℃)狀態(tài)下，達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的，并且解凍后輸精的過(guò)程。自Polge等1956年開(kāi)始豬的凍精研究試驗(yàn)以來(lái)，許多國(guó)家相繼開(kāi)展了此項(xiàng)技術(shù)的研究，目標(biāo)是提高它的繁殖成績(jī)，達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)生產(chǎn)可接受的水平。我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)已從傳統(tǒng)的副業(yè)型轉(zhuǎn)變到效益型、專(zhuān)業(yè)化的瘦肉產(chǎn)品生產(chǎn)，豬的常溫液態(tài)保存精液技術(shù)已經(jīng)被大面積地推廣和應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中。精液冷凍保存是人工授精的一項(xiàng)重大變革，不但解決了精液長(zhǎng)期保存的問(wèn)題，有利于本地豬種資源保護(hù)，還使精液不受時(shí)間、地域的限制，便于開(kāi)展省際、國(guó)際之間的協(xié)作，提高優(yōu)良種豬的利用率；而且極大地延長(zhǎng)了種豬基因物質(zhì)的使用壽命，使優(yōu)良種豬在短期進(jìn)行后裔測(cè)定，保留和恢復(fù)精液供應(yīng)、血統(tǒng)更新、引種、降低生產(chǎn)成本等方面均有重要意義。隨著全國(guó)性、區(qū)域性種豬聯(lián)合育種工作的深入開(kāi)展，豬的冷凍精液技術(shù)研究越來(lái)越顯得迫切。一、豬冷凍精液技術(shù)的現(xiàn)實(shí)意義和局限性 與豬的常規(guī)溫度（15℃～17℃)液態(tài)保存相比，豬的冷凍精液技術(shù)具有以下現(xiàn)實(shí)意義和局限性： 1) 由于凍精可以使優(yōu)良基因得到無(wú)限期的保存（如本地豬種資源保護(hù))，延長(zhǎng)公豬使用年限，而不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展； 2) 使種豬選擇擴(kuò)大到世界范圍的各群體進(jìn)行成為可能，不受時(shí)間或地理位置差異的限制，引進(jìn)國(guó)外高性能公豬凍精取代進(jìn)行活體公豬，可節(jié)省外匯支出； 3) 有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液可以在后裔測(cè)定或疾病檢測(cè)后才開(kāi)始大量供應(yīng)，為穩(wěn)定的遺傳進(jìn)展和嚴(yán)格的生物安全提供額外保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測(cè)提供了足夠的時(shí)間，凍精還為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時(shí)提供了穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障�！ ‘�(dāng)前，豬的凍精應(yīng)用估計(jì)占世界人工授精不到1%的比例(Wagner and Thibier 2000)，這個(gè)比例在許多年里都沒(méi)有大的變化(Reed 1985,Almlid and Hofmo 1996)�！ �4) 凍精沒(méi)有得到大面積的主要原因是繁殖成績(jī)不理想。與常規(guī)液態(tài)保存精液相比較，分娩率為40%～70%，低20%～30%，窩產(chǎn)仔數(shù)為7～10頭，少2～3頭（Johnson 1985,Almlid and Hofmo 1996)�！ �5) 凍精的體外活力和解凍后受精能力在不同的種公豬個(gè)體之間存在很大的差異�！ �6) 液態(tài)保存精液每劑只需要20～30億精子數(shù)，而凍精每劑需要更多的精子，一般為50～60億。 7) 成本高，從工作量和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備考慮，冷凍和解凍是一個(gè)耗費(fèi)資金的過(guò)程。 8) 需要可靠的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備以供準(zhǔn)確測(cè)試精液質(zhì)量，最大的問(wèn)題是解決體外精子的活力與其實(shí)際的受精力、受胎效果的相關(guān)性�！ �9) 把握適時(shí)輸精的時(shí)機(jī)。凍精輸入母豬體內(nèi)后的理想受精時(shí)間比液態(tài)保存精液大大縮短了。 因此，繼續(xù)改進(jìn)豬精子的冷凍和解凍操作方案仍是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一個(gè)課題。豬精子與其他家畜相比，有許多不同之處。它一次射精量大，采精后對(duì)外界溫度的突然改變相當(dāng)敏感（所謂的“冷
休克”反應(yīng))。冷凍精液技術(shù)的成功與否，關(guān)鍵在于對(duì)影響豬精子在冷凍和解凍過(guò)程中失去活力、保持受精能力等多因素的理解和監(jiān)控。這些因素包括外界因素、精子本身生物學(xué)特性、種公豬個(gè)體差異和每次采精的質(zhì)量差異。外界因素有稀釋液的組成成分、抗凍劑選擇及其濃度、稀釋比例和冷卻或緩沖速度、冷凍和解凍所采取的方法(Johnson et a1 2000)。遺憾的是我們只能通過(guò)改變外界因素來(lái)優(yōu)化冷凍精液操作過(guò)程和提高繁殖成績(jī)。 為了適應(yīng)
豬肉的高效、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)需要，全世界的種豬都在不斷地被更高遺傳水平的群體所更新，在一個(gè)國(guó)家或地區(qū)范圍內(nèi)，采用保存3～5天的液態(tài)精液或者活種豬進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞已經(jīng)足夠，但從我國(guó)幅員遼闊的地域、種豬的跨國(guó)家貿(mào)易和在遺傳交流時(shí)減少疾病傳播的角度考慮，豬的冷凍精液技術(shù)需求非常迫切。二、豬冷凍精液技術(shù)研究簡(jiǎn)史 1949年英國(guó)Polge等發(fā)現(xiàn)
甘油（丙三醇)對(duì)牛精子具有抗凍保護(hù)作用，1956年開(kāi)始應(yīng)用這個(gè)原理進(jìn)行豬精子的冷凍操作，但在1950～1960期間的研究結(jié)果中，冷凍保存、解凍后的精子具有活力，但無(wú)法獲得受胎結(jié)果。雖然在1970之前有幾例豬的凍精成功受胎的報(bào)道，但其結(jié)果不能被重復(fù)。1970年開(kāi)始，Polge 等學(xué)者利用外科腹腔授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管而獲得83%的受精卵，其后，多個(gè)研究小組如美國(guó)的Crabo and Einarsson 1971； Graham et a1 1971； Pursel and Johnson 1971；法國(guó)Paquignon & du Mesnil du Buissson 1973; 澳洲Salamon & Visser (1972，1973，1974)和德國(guó)的Westendorf et al （1975)相繼報(bào)道了以常規(guī)的子宮頸輸精并成功分娩的凍精技術(shù)試驗(yàn)結(jié)果，終于闡明低溫保存后豬的精子仍具有受精的能力。從此，世界學(xué)者為了把豬的冷凍精液技術(shù)應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中作了許多努力，并對(duì)操作程序進(jìn)行不斷優(yōu)化。迄今為止，人們?nèi)匝赜眉?xì)管(Westendorf et a1 1975) 、顆料(Pursel and Johnson 1975)及其改良型保存裝置進(jìn)行豬精子的冷凍和保存。雖然凍精仍保持一定的受精能力，但產(chǎn)活仔數(shù)、受胎率等繁殖結(jié)果明顯低于液態(tài)保存精液(Johnson 1985)。因此，采用長(zhǎng)效、低成本、切合實(shí)際的液態(tài)保存精液技術(shù)得到了不斷的改進(jìn)，可以部分解決國(guó)際間遺傳物質(zhì)的交流，受胎率也很接近自然交配結(jié)果。所以，即使凍精的繁殖效果與液態(tài)保存精液達(dá)到相似的程度，也不會(huì)取代液態(tài)保存精液技術(shù)的廣泛應(yīng)用地位。所以，豬冷凍精液技術(shù)在未來(lái)養(yǎng)豬業(yè)中的普遍應(yīng)用的價(jià)值仍存在不斷地爭(zhēng)議之處。三、冷凍保存方式 在一些早期研究中，豬的精子采用玻璃瓶(Polge 1956)或玻璃試管(Settergren 1958) 和較高濃度的甘油溶液進(jìn)行冷凍保存。后來(lái)，牛的粒狀干冰方法被應(yīng)用到豬上(Nagase and Niwa 1963)，把甘油溶液濃度降到1~3%的范圍，可以執(zhí)行快速冷凍降溫操作 (Purse1 and Johnson 1975)。公豬精子采用5ml大容量保存 (Westendorf et a1 1975), 4-5 ml 鋁袋(Waide et a1 1975), 0.5 ml 中型細(xì)管 (Fazano 1986, Baron 1986, Leps 1988), 1.7-2.0 mL 扁平大容量細(xì)管(Leps 1988, Moura 1988, Ewert 1988, Stampa 1989, Wegmann 1990, Simmet 1993), 和 0.25 mL 微型細(xì)管, 和不同類(lèi)型的5 mL 塑料袋 (Larsson et a1 1976, 1991b, Mwanza and Rodriguez-Martinez 1993, 1996)。所有這些保存類(lèi)型既有它的優(yōu)點(diǎn)又有它的缺點(diǎn)。顆粒和0.25 、0.5 mL小型細(xì)管有較大的表面積/容量比，是適合低溫冷凍保存的形狀。然而顆粒的冷凍精液較難進(jìn)行不同頭份/來(lái)源的區(qū)別，容易造成交叉污染且不易解凍。1頭份一般需要解凍10-20 根小型細(xì)管或2-3 根扁平細(xì)管，這是造成普遍推廣應(yīng)用的首要障礙。5 mL 的大型細(xì)管具有1頭份的精子數(shù)量，但其表面積/容量比較小，限制了理想的冷凍和解凍過(guò)程(Weitze et a1 1987)。對(duì)塑料袋包裝的測(cè)試結(jié)果一直表明能均勻地冷凍和解凍，并含有1頭份精子數(shù)量，但其體積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此無(wú)法采用。雖然5 mL大型細(xì)管Maxi-straw保存精子解凍后活力略低，但在實(shí)踐中易于操作，比顆粒的使用更加廣泛(Almlid and Hofmo 1996), 主要原因是不會(huì)引起交叉污染和在使用現(xiàn)場(chǎng)
更方便解凍。一些學(xué)者證實(shí)：微型、小型、中型細(xì)管，扁平細(xì)管和塑料袋保存的凍精樣品經(jīng)解凍后，比大型細(xì)管在精子直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)、頂體完整性、活力方面均表現(xiàn)得更加優(yōu)良(詳見(jiàn)Simmet 1993綜述)。大型細(xì)管Maxi-straw保存的精子活力低主要原因是位于細(xì)管中間的精子受冷不均勻，但從受精率考慮，活力并不是決定性因素，因?yàn)橐恍⿲W(xué)者報(bào)道了大型、中型、扁平的大型細(xì)管保存的凍精受精率無(wú)明顯的差異(Fazano 1986 and Stampa 1989)。盡管資料顯示利用扁平細(xì)管或5 ml塑料袋保存的凍精與大型細(xì)管Maxi-straws相比有更高的受精力、輸卵管富余精子更多，但這些保存方法在生產(chǎn)實(shí)踐中均沒(méi)有被推廣使用(Simmet 1993) (Bwanga et a11991b)。在目前的實(shí)踐應(yīng)用中，仍以傳統(tǒng)的顆�；蚣�(xì)管凍精為基礎(chǔ)。
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