豬瘟病毒及其致病機制
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豬瘟病毒及其致病機制研究進展（二)3.2 CSFV對體外培養(yǎng)細胞的影響 CSFV在豬體內感染并破壞多種細胞，使豬迅速發(fā)病、死亡 3- ；而在體外培養(yǎng)細胞中，CSFV一般不使培養(yǎng)細胞產(chǎn)生病理變化(Cytopathic effect，CPE)。但細胞可帶毒傳代，并在細胞分裂時將 病毒 傳至子代細胞中。CSFV在體外培養(yǎng)細胞中滴度低，是目前疫苗生產(chǎn)中一個比較難以解決的問題。 CSFV在豬的不同組織的細胞中增殖力不同，對淋巴系統(tǒng)細胞有嗜性。用豬淋巴細胞38A1D培養(yǎng)CSFV比用PK-15細胞系培養(yǎng)滴度高 6]。根據(jù)是否使培養(yǎng)細胞產(chǎn)生CPE，可將BVDV分為使培養(yǎng)細胞產(chǎn)生CPE的CP型BVDV和不使細胞產(chǎn)生CPE的nCP型BVDV。Hewicher-Trautwein等用BVDV感染綿
羊胎腦細胞培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)CP型BVDV與nCP型BVDV的細胞嗜性相同，主要在腦培養(yǎng)物中的神經(jīng)元、星形細胞及含纖黏連蛋白的細胞中增殖。CP型BVDV還可使部分細胞死亡，造成培養(yǎng)物中細胞類型減少。感染CSFV的豬后期表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，推測CSFV與BVDV一樣具有嗜神經(jīng)性 7]。CSFV在神經(jīng)細胞中增殖，損傷了神經(jīng)細胞，從而影響了神經(jīng)系統(tǒng)的功能，使瘟豬表現(xiàn)出運動失調等癥狀。尸體剖檢證實了CSFV在
豬腦神經(jīng)元及膠質細胞中存在 8]。 瘟 病毒 屬病毒對不同宿主的神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)的細胞有嗜性，這種細胞嗜性有可能是導致宿主迅速發(fā)病、死亡的重要原因之一。研究CSFV等瘟病毒屬病毒對體外培養(yǎng)的不同種類細胞的嗜性及對宿主細胞的影響，對了解CSFV致病機制及其防控至關重要。 值得一提的是，為了研究CSFV的分子生物學和免疫學特征，提高其病毒滴度是非常關鍵的。用Roux培養(yǎng)瓶或轉瓶在
豬腎細胞PK-15上培養(yǎng)CSFV是應用最為廣泛的方法，其滴度一般在106～107TCID50/mL。而應用微載體細胞培養(yǎng)技術，至少可將CSFV的滴度提高10倍。這種微載體(Cytodex3R，Pharmacia)是一種多孔微珠，將其加于懸浮細胞培養(yǎng)物中，在37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中搖動培養(yǎng)時，細胞即可貼附在微載體上生長。由于減少了培養(yǎng)基用量，同時擴大了細胞的培養(yǎng)量，從而使CSFV的滴度比一般貼壁培養(yǎng)的毒價提高了1.5個滴度，且這種微載體經(jīng)處理后仍可繼續(xù)使用，因此，微載體細胞培養(yǎng)也是提高CSFV滴度的一個比較好的方法 8] 3.3 CSFV在體內的復制過程 CSFV感染宿主細胞后，在宿主細胞中復制完成感染過程。CSFV吸附在細胞表面，并通過其囊膜糖蛋白Erns和E2細胞膜的融合或經(jīng)受體介導的胞飲作用進入感染細胞 9] 。在體外培養(yǎng)CSFV感染的豬腎細胞時，在細胞上傳代引起Erns蛋白C端Ser476突變?yōu)锳rg殘基，這一改變使得不依賴硫酸乙酰
肝素(HS)的病毒變?yōu)槔肏S作為Erns受體的病毒，CSFV通過其Erns和細胞表面的HS的相互作用而完成最初的結合 9]。病毒進入細胞及隨后其RNA從核衣殼中釋放的機制尚不清楚。由于CSFV基因組RNA只有一個開放閱讀框，因此其表達產(chǎn)物是一個3 898
氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein)，而后再經(jīng)病毒自身的或細胞的蛋白酶作用，將其裂解成數(shù)個結構蛋白與非結構蛋白(圖2)。 CSFV開放閱讀框編碼的第一個蛋白是分子質量為23 ku的多肽p23，以前曾認為它就是病毒核衣殼蛋白，但實際上核衣殼蛋白是一個位于p23和第一個病毒蛋白E0之間的14 ku蛋白P14。p23本身具有蛋白水解酶活性，可使P14與p23之間迅速斷裂，離開多聚蛋白 9-10]。 E2下游區(qū)翻譯產(chǎn)物的研究比較少，主要是非結構蛋白的表達。在1 030位～1 310位氨基酸殘基之間有一70個氨基酸組成的疏水區(qū)域，Collett認為此疏水多肽可能與內質網(wǎng)膜的結合有關 1 。對瘟病毒屬中牛病毒性
腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)和邊界病毒(Border disease virus，BDV)的研究發(fā)現(xiàn)，非結構蛋白p125在表達后即被加工成p54和p80。p80在瘟病毒間呈極高同源性，p80屬于以Eif-4a為代表的類解螺旋酶(helicase like)超家族，并形成絲氨酸蛋白結構域的一部分，因而p80是一個雙功能蛋白，但尚未發(fā)現(xiàn)CSFV p125被加工成p80。在ORF3′端的表達產(chǎn)物中存在一段Gly-Asp-Asp序列，可能代表著病毒RNA依賴的RNA聚合酶的一部分 1 。 衣殼蛋白在合成后幾分鐘內即與基因組RNA相結合，包裝進入核衣殼。E2-E2、E2-E0及E2-E1之間由二硫鍵(或個別較強的非共價鍵)連接成同型或異型二聚物，形成病毒的囊膜抗原。因此，二聚化可能在病毒裝配中非常重要 9]。E2、E1的C端有疏水性氨基酸殘基組成的結構，可作為跨膜結構域，使之鑲嵌于CSFV囊膜脂雙層中，E0無此疏水結構，它與病毒粒子的聯(lián)系尚不清楚，可能與E2形成異源二聚體，但這種聯(lián)系不如E1和E2那樣牢固 1 。外膜蛋白糖基化后，通過內質網(wǎng)和高爾基體搬運到胞漿膜，成為一種跨膜蛋白。應用電鏡超薄切片技術對感染細胞中病毒的形態(tài)發(fā)生進行觀察的結果顯示，CSFV在胞內增殖的主要部位是有豐富膜系統(tǒng)的細胞核周圍。成熟的病毒粒子多見于細胞質中充滿無定型基質的膜囊中，有時可觀察到膜囊在質膜處的開口以及周圍的無定型基質和其中的成熟病毒，提示CSFV可能通過這一特殊的結構向外釋放，且多數(shù)釋放的病毒依然吸附在無定型基質中。Gray等(1987)研究發(fā)現(xiàn)，在BVDV感染的細胞表面無病毒蛋白，這一現(xiàn)象推測BVDV是在宿主細胞內的一種光滑小膜泡中裝配后，聚集在一起，再經(jīng)胞吐作用，將成熟病毒釋放出來。CSFV是否也以類似方式裝配和釋放還不清楚，但基于瘟病毒種間的相似性，可以設想CSFV也是由細胞表面以芽生方式釋放。 CSFV與宿主細胞相互作用機制的研究對該病的預防和控制具有重要的意義。隨著生物技術的進一步提高，許多尚不清楚的方面如病毒致病機制、宿主抗病毒機理等都將逐步得到揭示，并在此基礎上開發(fā)和研制高效、安全的新型疫苗，在該病的防控中發(fā)揮重要作用。
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