| 公開(公告)號 | CN100363485C |
| 公開(公告)日 | 2008.01.23 |
| 申請(專利)號 | CN200410027944.4 |
| 申請日期 | 2004.07.07 |
| 專利名稱 | 制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法 |
| 主分類號 | C12N1/20(2006.01)I |
| 分類號 | C12N1/20(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 深圳新鵬生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李政海;李 靜;李繼東 |
| 地址 | 518057廣東省深圳市南山區(qū)高新技術(shù)園北區(qū)郎山二路 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 深圳市博銳專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 張 明 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項 | 一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法，所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF，其發(fā)酵過程包括種子液培養(yǎng)和分批補(bǔ)料發(fā)酵，其特征在于： 所述種子液培養(yǎng)包括以下子步驟： 1)菌種的篩選：從菌種保存庫中取出所述工程菌，劃LB平板30℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB試管中培養(yǎng)，至OD600值為0.4-0.6，再于42℃培養(yǎng)4小時，離心收集菌體，SDS-PAGE分析，用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)量最高的克隆作為發(fā)酵用種子，分裝甘油保存，每批發(fā)酵取用一支； 2)一級種子液培養(yǎng)：將種子按2％的體積比接種到含2YT種子培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min搖床培養(yǎng)，至OD600值為0.6-1.0； 3)二級種子液培養(yǎng)：將一級種子液以1％的體積比接種到含200ml 2YT種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，搖床培養(yǎng)12-16小時，至OD600值為3.5-6.5，鏡檢無雜菌，菌種形態(tài)正常，即為發(fā)酵用種子； 所述分批補(bǔ)料發(fā)酵包括以下子步驟： A.發(fā)酵前的準(zhǔn)備：將8L發(fā)酵培養(yǎng)基接入到20L的發(fā)酵罐中，115℃滅菌30分鐘； B、基本發(fā)酵：滅菌后，待培養(yǎng)基溫度降到30℃時，按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養(yǎng)8小時，開始誘導(dǎo)表達(dá)； C、誘導(dǎo)發(fā)酵：誘導(dǎo)溫度為42℃，誘導(dǎo)4小時，結(jié)束發(fā)酵； 上述分批補(bǔ)料發(fā)酵子步驟B和C中，通過補(bǔ)加4mol/L氫氧化鈉控制pH為7.0-7.1，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的空氣流速和轉(zhuǎn)速，控制溶氧值為50％；并且當(dāng)OD600值為2時，開始補(bǔ)料，補(bǔ)料方式為每小時補(bǔ)加補(bǔ)料I和II各100ml； 所述補(bǔ)料I的配方為：葡萄糖300g，硫酸銨50g，加純化水定容至1L； 所述補(bǔ)料II的配方為：酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，維生素B1 0.1g，加純化水定容至1L。 |
| 摘要 | 一種制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法，所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF，其發(fā)酵過程包括種子液培養(yǎng)，包括以下子步驟：①.菌種的篩選；②.一級種子液培養(yǎng)；③.二級種子液培養(yǎng)；和分批補(bǔ)料發(fā)酵，包括以下子步驟：①.發(fā)酵前的準(zhǔn)備；②.基本發(fā)酵：按接種量10％體積比接入二級種子液，30℃，培養(yǎng)8小時，開始誘導(dǎo)表達(dá)；③.誘導(dǎo)發(fā)酵：誘導(dǎo)溫度為42℃，誘導(dǎo)4小時，結(jié)束發(fā)酵；上述分批補(bǔ)料發(fā)酵子步驟②和③中，控制pH為7.0-7.1，溶氧值為50％；并且當(dāng)OD600值為2時，開始補(bǔ)料，每小時補(bǔ)加一定量的補(bǔ)料Ⅰ和Ⅱ。本發(fā)酵方法，為解決人粒細(xì)胞集落刺激因子制備上存在的表達(dá)率偏低、菌體產(chǎn)量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題提供了可能。 |
| 國際公布 |
