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公開(公告)號(hào)
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CN101063125A
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公開(公告)日
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2007.10.31
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200710020892.1
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申請(qǐng)日期
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2007.04.17
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專利名稱
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人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品
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主分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/62(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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江南大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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沈 微;金 堅(jiān);諸葛健;王 俊;張蓮芬
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地址
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214122江蘇省無錫市蠡湖大道1800號(hào)
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頒證日
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國際申請(qǐng)
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
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代理人
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時(shí)旭丹;劉品超
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國省代碼
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江蘇;32
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主權(quán)項(xiàng)
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人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核甲狀旁腺細(xì)胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA；通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到PTHcDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增獲得HSAcDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接HSAcDNA和PTHcDNA，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HAScDNA融合基因插入到克隆載體，PTH-HAScDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，PTH-HAScDNA融合基因被整合到宿主的染色體中； (1)PTHcDNA的克�。� 以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的PTHcDNA第一鏈為模板，通過PCR擴(kuò)增出PTHcDNA，所用的引物如下： p1：5’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’ p2：5’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl，PCR條件為：95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)35次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；隨機(jī)挑取5個(gè)單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對(duì)重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH； (2)HSAcDNA的克隆： 利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴(kuò)增出HSAcDNA，所用的引物為： PH1：5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’ PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer1μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptIIKS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對(duì)重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點(diǎn)間區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS； (3)PTHcDNA和HSAcDNA融合基因的克�。� HSAcDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’ P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； PTHcDNA的PCR擴(kuò)增，所用引物如下： P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’ P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’ PCR方法如下：50μl的反應(yīng)體系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH1μg，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 利用重疊PCR融合PTHcDNA和HSAcDNA： 將PTH的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和HSA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以4∶6體積比混合后作為模板，于50μl的反應(yīng)體系中加入：2mmol/L的dNTP5μl，10×pfuBuffer5μl，5U/μl的pfuDNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補(bǔ)齊50μl；PCR條件為：95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次； 通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用P
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摘要
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人甲狀旁腺激素(PTH)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，將HAS cDNA和PTH cDNA進(jìn)行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區(qū)。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯�，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素生理特性的基礎(chǔ)上，延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其溶解度，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
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國際公布
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