| 公開(公告)號 | CN1865430A |
| 公開(公告)日 | 2006.11.22 |
| 申請(專利)號 | CN200510013514.1 |
| 申請日期 | 2005.05.16 |
| 專利名稱 | 一種高產(chǎn)促胰島素激素的畢赤酵母工程菌及其構建方法 |
| 主分類號 | C12N1/19(2006.01)I |
| 分類號 | C12N1/19(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 李明剛;侯建華;方園園;薄 濤;王翠艷;楊少輝;武志強;閆瑞香 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 天津市學苑有限責任專利代理事務所 |
| 代理人 | 鄭 楠 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權項 | 一種促胰島素激素高產(chǎn)畢赤酵母工程菌的構建方法，其特征在于包括： a)構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP-1： 根據(jù)畢赤酵母表達載體pPIC9質(zhì)粒多克隆位點的序列特點，設計上游引物和下游引物，將克隆的GLP-1直接連入T-vector得到pMDGLP-1，用SmalI和NotI酶切得到GLP-1基因片段；質(zhì)粒pPIC9用XhoI酶切后補平粘端；再用NotI酶切，回收大片段；將GLP-1基因片段與pPIC9大片段通過T4DNA連接酶連接，篩選陽性轉化子從而完成畢赤酵母表達載體pPIC9GLP-1的構建； b)構建畢赤酵母GLP-1生產(chǎn)菌株： 重組質(zhì)粒pPIC9GLP-1用SacI酶切使之線性化，再以醋酸鋰轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115感受態(tài)細胞；在MD培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天，挑取陽性轉化子，獲得畢赤酵母GLP-1生產(chǎn)菌株； c)篩選畢赤酵母GLP-1高產(chǎn)菌株： 通過PCR、Southern雜交和Western blot等方法對轉化子進行分子檢測，確證GLP-1基因已整合到基因組并正確表達；將各轉化子畢赤酵母細胞接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)40～48小時，250r/min，無菌條件下離心棄上清，換成BMMY液體培養(yǎng)基；在誘導過程中，每24小時加入適量甲醇使其終濃度維持在0.75％附近；培養(yǎng)60小時后離心收集各轉化子的上清培養(yǎng)基；用Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳和密度掃描法檢測轉化子的GLP-1的分泌表達產(chǎn)量，篩選出畢赤酵母GLP-1高產(chǎn)菌株。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)促胰島素激素畢赤酵母(Pichia pastoris)工程菌及其構建方法。本發(fā)明運用分子生物學技術先構建畢赤酵母(P.pastoris)表達載體pPIC9GLP-1，然后將其線性化后轉化進入畢赤酵母GS115中，從而獲得能夠高效分泌表達促胰島素激素的畢赤酵母工程菌，該工程菌的促胰島素激素產(chǎn)量可達到100mg/L。同時，利用該高產(chǎn)工程菌生產(chǎn)的促胰島素激素產(chǎn)品，其氨基酸序列不同于天然產(chǎn)品，且已被消除了胰蛋白酶切位點，因此不僅在體內(nèi)不會被特異性的蛋白酶降解而能夠長時間的保持活性，而且由于不會被胰蛋白酶降解，還可以制成口服制劑使用。 |
| 國際公布 |
