空氣負氧離子抑制肝癌細胞的實驗研究
                             ———關于森肽基生態級負氧離子生成機的實驗研究
           陶名章1，李慧2，陳少周3，李海濤4
（1．中國空氣負離子暨臭氧研究學會，廣州510300；2. 南方醫科大學附屬南方醫院呼吸睡眠中心，廣州510516;3.香港瑪麗醫院精神科，香港999077；4.中山大學附屬第一醫院神經內科，廣州510080）

【摘要】目的 研究空氣負氧離子對肝癌Hepa1-6細胞生物活性的影響。
    方法 把細胞隨機分為3組：空白對照組，空氣對照組和負氧離子治療組。治療組根據負氧離子作用時間分為1h組、2h組和4h組。對細胞進行Tunel染色檢測凋亡情況，流式細胞儀檢測細胞周期變化情況，以WesternBlot法檢測磷酸化P38MAPK的表達變化。
    結果 與空白對照組和空氣對照組比較, 空氣負氧離子治療組肝癌細胞凋亡率明顯增加,處于S期肝癌細胞所占有的比例下降明顯, 磷酸化P38MAPK 表達上升明顯, 差異均具有統計學意義(P < 0.05)。
    結論 空氣負氧離子通過阻滯細胞周期使腫瘤細胞發生凋亡, 進而抑制腫瘤細胞，該效應是通過P38MAPK信號通路傳導來實現的。
【關鍵詞】空氣負氧離子，空氣負離子，肝癌，P38MAPK
Study of Negative oxygen ions inhibiting liver cancer cells in vitro
TAO Ming-zhang1，LI Hui2,CHEN Shao-zhou3,LI Hai-tao4
(1.China on Negative Air Ions and Ozone Reseach Society，Guangzhou 510300，China；2. Center of Respiration and Sleep，Nanfang Hospital Affiliated Nanfang Medical College，Guangzhou 510516，China；3. Department of Psychiatry，Hongkong Queen Mary Hospital，Hongkong 999077，China；4. Department of Neurology，First Hospital Affiliated SUN YAT-SEN University，Guangzhou 510080，China )
【Abstract】Objective：To investigate the affect on the biologic activity of hepatoma Hepa1-6 cell line of negative oxygen ions in vitro. Methods Dividing the cell into three groups: negative control group, air control
group and treatment group，randomly.Dividing the treatment group into 1h、2h and 4h group according to action time of negative oxygen ions, all the cells in each group were detected apoptosis and cell cycle with flow cytometry method, the phospho- P38MAPK expression was detected.
by Westernblot assay. Results：The apoptosis rate increased, the proportion of  S stage cell decreased and the expression of phospho- P38MAPK increase obviously vs negative and air control group, the difference show significance ( P < 0.05).
Conclusion：The negative oxygen ions can induce hepatoma Hepa1-6 cell apoptosis through arresting the cell cycle, such effect was mediated by P38MAPK pathway.
Key words: Negative oxygen ions; Negative air ions; Hepatoma; P38MAPK

    被譽為空氣維生素的空氣負氧離子對人體健康十分有益。研究表明，它能有效調整大腦皮層的功能，有鎮靜、催眠及降血壓作用；它能使支氣管平滑肌松弛，解除其痙攣，有效緩解哮喘；它還可以降低血脂水平，提高機體免疫力及抗腫瘤作用等[1-4]。目前大多數研究集中于流行病學方面的研究，而對于抗腫瘤和及其作用機理的研究很少。本實驗就空氣負氧離子對體外肝癌細胞的影響進行了系列研究。
1. 材料與方法
1.1 材料
    肝癌細胞株Hepa1-6（上海艾研生物科技有限公司）；碘化丙啶（美國Sigma 公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（德國Boehringer Mannheim公司）；鼠抗人單克隆抗體P38MAPK和P38MAPK 特異性抑制劑SB203580（美國On-cogene公司），SB203580 使用終濃度為50μmol/L；森肽基生態級負氧離子生成機（濟南新活電器公司）；Model IC-2000型空氣負離子檢測器（瑞典，空氣負離子檢測裝置）。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組
    把處于對數生長期的肝癌細胞Hepa1-6隨機分成3組, 即空白對照組、空氣對照組及負氧離子治療組。治療組根據空氣負離子作用時間分成1h組、2h組和4h組。對照組處理：孵箱中給予普通空氣；空氣負氧離子組：將孵箱改造成相對密閉的空間,通過自制的裝置輸入由森肽基生態級負氧離子生成機產生的空氣負氧離子,同時應用空氣離子檢測器來檢測空氣負離子濃度, 在實驗前保證空氣負氧離子濃度不高于500 /cm3,電離后維持空氣負氧離子濃度在( 2- 3)×106 /cm3。
1.2.2  TUNEL染色 
    胰蛋白酶消化5-10代肝癌細胞, 制成密度為105/ml左右的細胞懸液。加細胞懸液于蓋玻片上, 4h后細胞貼壁, 添加培養基。待細胞生長達50%-60%, 用無血清DMEM 培養液洗2次, 再加條件培養液, 繼續培養48h, 收集蓋玻片并應用4% 多聚甲醛固定,爬片制作成功后按照以下步驟染色: ⑴梯度乙醇水化; ⑵3ml/L H2O2封閉30min; ⑶20mg/L蛋白酶K消化液作用20min; ⑷TUNEL反應液, 37℃孵育60min; ⑸過氧化物酶連接的抗熒光素抗體, 37℃孵育30min;注意：以上2-5步以后均以10mmol/L PBS( pH7.4)輕輕振洗3次, 每次5min; ⑹DAB 顯色, 蘇木素復染, 脫水透明, 封片。以PBS 替代TUNEL反應液作陰性對照, 陽性對照爬片經DnaseⅠ預處理10min, 再接TUNEL染色步驟。結果判定: 光鏡下觀察TUNEL染色爬片的顯色反應, 數5個以上高倍視野, 不少于1000個細胞, 重復5次。細胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞, 即凋亡細胞。記數陽性細胞數并以百分數表示, 作為細胞凋亡指數。
1.2.3 應用流式細胞儀進行細胞周期分析
    收集消化的貼壁細胞, PBS 沖洗后重懸在4℃、70%的乙醇中1-2h, 以1000r/min離心細胞后重懸在含100mg/L RNA 酶和10mg /L碘化丙啶的PBS中,在25℃避光孵育15min。用FACScalibur流式細胞儀進行單色熒光細胞流式計數。結果用Multiplus Software軟件分析數據, 每個樣本收集10000個細胞, 重復3次。
1.2.4  Westernblot方法檢測空氣負離子作用前后磷酸化P38MAPK 的蛋白表達
    取體外培養的107~108個Hepa1-6細胞在1ml RIPA裂解緩沖液中勻漿提取蛋白, 測定提取的蛋白濃度。每個上樣孔加樣30μg蛋白, 經電泳、轉膜后雜交, 一抗為山羊抗人磷酸化P38MAPK單抗( Santa Cruz公司, 1：400), 二抗為HRP標記兔抗山羊IgG抗體( Santa Cruz公司, 1：4000) , ECL顯色( Amersham公司) , 拍照, 密度掃描測各條帶吸光度( IA )。以IA (目的條帶/β-actin對照條帶) , 表達各標本上述蛋白含量, 重復10次。
1.3 統計學處理 
    采用SPSS13.0軟件進行統計學分析, 計量資料用( ±s)表示, 采用t檢驗。
2. 結果
    凋亡率、S期占有率及P38MAPK的IA值詳見下表。（缺乏說明性結果，不利于宣傳）

表1 凋亡率、S期占有率及P38MAPK的IA值

注：空氣負氧離子的2h、4h組與空白對照、空氣對照組及SB203580組比較，t=0.029（＊P﹤0.05）；空氣負氧離子4h組與1h、2h相比，t=0.031（＃P﹤0.05）。
3. 討論
    國外對空氣負離子的研究比較早，開始于十九世紀五十年代。目前已經證明空氣負離子有調整大腦皮質功能、改善睡眠、降低血壓、加強氣管粘膜細胞纖毛運動、增加基礎代謝率、增進食欲、提高機體免疫力等作用�？諝庳撗蹼x子濃度在達到一定程度時才具有治療作用。研究發現，當空氣負離子濃度達到700個/cm3以上時才有益于人體健康; 當濃度達到1萬個/cm3以上時才能治病; 當負離子濃度大于或等于正離子濃度時, 才能使人感到舒適, 并對多種疾病有治療作用。當空氣中的陽離子含量較高時，可以增加人們的焦慮感，而負離子卻可以使人放松神經和心情作用。Yamada等[5]研究認為空氣負離子可以降低由高脂飲食而造成高脂血癥的小鼠的紅細胞的聚集作用。Iwama報道[6]空氣負離子可以提高紅細胞的變形能力以及有氧代謝能力。Yamada等[2] 的研究證實了空氣負氧離子可以明顯抑制小鼠的腫瘤的產生和擴散, 其機制與其增加小鼠體內的NK 細胞的活性相關, 其抗腫瘤作用與其吸入的時間和劑量成正比。西安醫科大學、陜西省腫瘤醫院選擇臨床晚期惡性腫瘤56例，其中肺癌30例、食管癌8例、惡性淋巴瘤10例，乳腺癌8例，隨機分層抽樣，實驗組（吸入空氣負離子加化療）30例，對照組（單純化療）26例。半年后，結果顯示：吸入空氣負離子的實驗組改善總體療效率為93.33%，對照組為65.38%，表明吸入空氣負離子的實驗組總體療效率明顯高于對照組[7]。李克亮等人[8]的實驗研究發現: 每天大量吸入空氣負離子，絕大部分動物可不發生肺內轉移瘤。原發瘤亦受到抑制，早期應用遠高于晚期應用，但晚期應用也有一定效果。但是目前關于負氧離子對細胞水平的作用效果及機制的相關研究比較少。我們此次實驗通過對體外培養的肝癌細胞觀察空氣負離子直接作用在細胞上所產生的生物學反應, 結果發現空氣負離子可以明顯誘導肝癌Hepa1-6腫瘤細胞的凋亡, S期細胞在各期細胞中所占有的百分率明顯下降, 同時在細胞發生凋亡時表達的磷酸化的P38MAPK 明顯增加, 其中以負離子作用時間4h組最為明顯, 與1h和2h組相比,差異具有統計學意義( P< 0.05)。加入SB203580后在抑制了P38MAPK的同時也抑制了其他一系列生物學效應。這說明空氣負離子通過使細胞周期阻滯而使腫瘤細胞發生凋亡, 這種效應是通過P38MAPK這條信號通路傳導的。本實驗結果與吉林大學第一醫院的李丹等[9]人的研究結果類似，空氣負離子可以通過P38MAPK信號通路明顯誘導肝癌SMMC-7721腫瘤細胞的凋亡，可以使S期肝癌細胞在各期細胞中所占百分率明顯下降。

                        參考文獻

[1] Krueger AP, Reed EJ. Biological impact of small air ions[J]. Science, 1976,193(4259): 1209-1213.
[2] Yamada R, Yanoma S, Akaike M, et al. Water-generated negative air ions activate NK cell and inhibit carcinogenesis in mice[J]. Cancer Lett, 2006,239(2): 190-197.
[3] 陶名章, 李慧, 陳少周,等. 人工空氣負離子療法改善失眠患者睡眠質量的臨床研究[J]. 中國當代醫藥, 2011,18(2): 7-8.
[4] 陶名章, 李慧, 陳少周,等. 人工空氣負氧離子對高脂血癥的臨床療效研究[J]. 中國醫藥導報, 2011,11(1): 10-11.
[5] Yamada S, Chino D. Inhibitory effects of negative air ions on erythrocyte aggregation[J]. Med & Bio, 2000,141: 79-83.
[6] Iwama H. Negative air ions created by water shearing improve erythrocyte deformability and aerobic metabolism[J]. Indoor Air, 2004,14(4): 293-297.
[7] 張振軍, 向玉琴, 李安伯,等. 空氣負離子治療晚期惡性腫瘤療效觀察[J]. 靜電, 1995,10(4): 32-33.
[8] 李克亮, 趙永荃. 空氣負離子抑制癌轉移實驗的初步報告[J]. 中國腫瘤臨床, 1994,21(9): 701.
[9] 李丹, 李柏昌, 范艷艷. 空氣負離子對體外培養的肝癌SMMC-7721細胞的抑制作用及其相關的信號傳導機制[J]. 臨床肝膽病雜志, 2008,24(5): 358-360.