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2 納米材料對PCR體系的影響
2.1 金納米粒子對PCR體系的影響
Li等[23]將10 nm的金納米粒子作為一種新型的優(yōu)化劑添加到PCR體系中，考察了金納米粒子對PCR特異性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金納米粒子的濃度介于0.4～0.8 nmol/L之間時(shí)，隨著金納米粒子濃度的不斷增高，PCR的特異性越來越好；但當(dāng)金納米粒子濃度大于1.0 nmol/L時(shí)，PCR的特異性又被抑制。而且，加入金納米粒子在保持PCR產(chǎn)量和特異性的前提下，可以拓寬PCR體系的退火溫度范圍，退火溫度即使低至25 ℃，PCR仍具有較好的特異性。Li等[23]認(rèn)為金納米粒子模擬了體內(nèi)DNA復(fù)制過程中單鏈結(jié)合蛋白SSB的作用，選擇性地結(jié)合了單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，從而顯著降低了DNA復(fù)制過程中引物和模板的錯(cuò)配。此前，Perales等[24]通過模擬生物體內(nèi)的擴(kuò)增策略，成功地將耐熱的SSB蛋白引入到PCR體系中，提高了PCR的特異性。
Vu等[25]深入探討了金納米粒子對PCR體系特異性的影響。發(fā)現(xiàn)金納米粒子的作用不是增加PCR的特異性，而是更有利于小片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制大片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，不論該小片段產(chǎn)物是特異性產(chǎn)物還是非特異性產(chǎn)物。而且，隨著金納米粒子濃度的增加，這種作用越來越明顯。他們認(rèn)為金納米粒子能促進(jìn)小片段的擴(kuò)增，是因?yàn)榧{米金與聚合酶發(fā)生了非特異性結(jié)合，是表面化學(xué)作用起到重要作用醫(yī).學(xué).全.在.線m.gydjdsj.org.cn。
Li等[26]研究了13 nm的金納米粒子對PCR體系效率的影響。實(shí)驗(yàn)表明，金納米粒子能使PCR體系的產(chǎn)量提高104～106倍，反應(yīng)時(shí)間越短，金納米粒子對PCR體系產(chǎn)量的提高就越明顯。而且，相同量的金納米粒子對不同升降溫速度的PCR體系的影響不同。與不加金納米粒子的PCR體系相比，金納米粒子對升/降溫速度為20 ℃/S的實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)量的提高可高達(dá)104倍， 而對升/降溫速度為2 ℃/S的普通PCR體系， 金納米粒子對其產(chǎn)量的提高只有5～10倍，PCR體系的熱循環(huán)越快，金納米粒子對PCR產(chǎn)量的提高就越大。Li等[26]認(rèn)為，金具有良好的熱傳導(dǎo)性，改善了快速升降溫PCR體系的熱傳導(dǎo)性，有利于模板與引物更高效的配對，從而提高了PCR的產(chǎn)量，優(yōu)化了PCR體系。
對于金納米粒子與PCR各參數(shù)的相互作用，文獻(xiàn)[27，28]報(bào)道了引物共價(jià)鍵合到金納米粒子表面的PCR。結(jié)果表明，一條引物（上游引物或者下游引物)或者兩條引物連接到金納米粒子上，在一定范圍內(nèi)，退火溫度對PCR體系幾乎沒有影響，PCR特異性均較好。
米麗娟等[29]研究PCR體系中納米金與DNA聚合酶的相互作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，過量的納米金之所以會(huì)抑制PCR擴(kuò)增，是因?yàn)榧{米金與聚合酶發(fā)生了相互作用。若提高聚合酶用量，可有效消除金納米粒子的這種抑制作用。在PCR體系中，納米金通過與游離的DNA聚合酶的可逆結(jié)合，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)聚合酶的濃度，進(jìn)而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果。但該機(jī)理僅從納米金與聚合酶的相互作用出發(fā)，考慮到PCR體系的復(fù)雜性，納米金還有可能與模板、引物等發(fā)生了復(fù)雜的相互作用，更為確切的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。
納米金還可以優(yōu)化PCR的擴(kuò)增策略。 Pan等[30]研究基于納米金的多輪擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，由于納米金可以抑制PCR的非特異擴(kuò)增，可以將PCR的有效擴(kuò)增極限推到第7輪，即使在第6輪擴(kuò)增中也能得到單一明亮的目標(biāo)條帶。而在常規(guī)PCR多輪擴(kuò)增中，無論對DNA模板如何稀釋，有效擴(kuò)增只能進(jìn)行到第3輪，且隨著擴(kuò)增輪數(shù)的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的量也呈下降趨勢。納米金輔助的PCR再擴(kuò)增和多輪擴(kuò)增在一定程度上可取代巢式PCR，避免了巢式PCR需要設(shè)計(jì)兩對引物的繁瑣。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，表面修飾了BPS、莖環(huán)DNA、以及Triton-100的金納米粒子，雖然表面性質(zhì)發(fā)生了改變，但是仍然能提高PCR的特異性和產(chǎn)量。
2.2 銀納米粒子對PCR體系的影響
王群等[31]探討了銀納米粒子對PCR體系長片段DNA反復(fù)擴(kuò)增的特異性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對長度為3~6 kb的較長片段基因，銀納米粒子在一定程度上保持了其PCR反復(fù)擴(kuò)增的特異性；而對10 kb以上更長片段的反復(fù)擴(kuò)增，銀納米粒子對其特異性的影響比較小。他們認(rèn)為，可能是銀納米粒子性改善了常規(guī)PCR體系溶液的導(dǎo)熱性能，縮短了整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，從而抑制了非特異擴(kuò)增；也可能是銀納米粒子與不同狀態(tài)DNA分子發(fā)生了選擇性結(jié)合，從而提高了擴(kuò)增的特異性醫(yī).學(xué).全.在.線m.gydjdsj.org.cn。
