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F：5ˊGAAAAGCTTATGGCGCGGTTCCTGACA3ˊ
R：5ˊGCCGGATCCTTAAAATCTCATAAATCCTC 3ˊ通過RTPCR擴增PENK目的基因�？俁NA先70℃變性5 min，冰浴冷卻后加入反應體系，反應物總體積為20 μL，離心混勻后，置于42℃恒溫水浴鍋中水浴1 h，然后移至70℃水浴5 min滅活反轉錄酶，產物為人腦組織的總cDNA。反應結束后，取PCR反應液5 μL進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR的擴增產物。
1.5 TPENK載體的構建 利用膠回收試劑盒將PCR產物的DNA目的片段純化回收，將回收片段與T載體連接，轉染大腸桿菌 JM109，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，對陽性克隆擴大培養(yǎng)提取TPENK重組質粒。
1.6 pEGFPC3PENK真核表達載體的構建及鑒定 按1∶3比例將TPENK載體和pEGFPC3載體混合后用HindⅢ和BamHI雙酶切成線狀并經電泳回收，混合后16℃連接過夜，連接產物用42℃水浴熱擊法轉入JM109感受態(tài)細菌內鋪含Amp+的瓊脂平板，倒置37℃培養(yǎng)12～16 h，通過菌落PCR和酶切法鑒定陽性克隆，并取PCR陽性克隆菌送上海生物工程公司測序。
2 結果
2.1 人前腦啡肽原基因的克隆 通過RTPCR法擴增出的PENK基因與預測的基因基本一致(見圖1)。
1：Marker 2：針對pEGFPC3設計的引物所擴PENK基因
圖1 人前腦啡肽原基因的PCR電泳圖
2.2 重組質粒的雙酶切鑒定與測序結果 從圖2中可以看出，酶切出約800 bp(PENK)和5 000 bp (pEGFPC3)的DNA片段。與理論計算一致，命名為pEGFPC3PENK。測序結果與GenBank報道的序列完全吻合，載體構建成功醫(yī).學全.在.線網站m.gydjdsj.org.cn。
1：Marker 2、3：酶切新載體所得PENK和pEGFPC3片段
圖2 構建新載體的酶切電泳圖
3 討論
疼痛治療是醫(yī)學界的長期研究課題。目前緩解疼痛的主要治療藥物仍是阿片類藥物，其成癮性和毒副作用大等特點又使其臨床應用受限。腦啡肽是一種神經遞質，阿片受體的內源性配體,通過阿片受體介導的抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制磷脂酰肌醇水解等細胞內信號傳導途徑發(fā)揮作用。腦啡肽包括甲硫氨酸腦啡肽(MEK)和亮氨酸腦啡肽(LEK)具有鎮(zhèn)痛效果好、副作用少的優(yōu)點，但腦腓肽易被腦啡肽酰A或B降解成無活性的衍生物，因此找到一種持續(xù)分泌內源性腦啡肽，且具有臨床可行性的方法，成為研究的主要方向。前腦啡肽是腦腓肽的前體,在翻譯過程中經不同的蛋白酶降解形成上述兩個具有鎮(zhèn)痛作用的活性阿片肽。前腦啡肽源基因是慢性疼痛基因治療中一種較為理想的基因選擇，是目前國內外研究的熱點。楊茂元等[6]先用在脂質體介導下將人前腦啡肽源基因(human preproenkephalin，HPPE)轉染鼠成纖維細胞系NIH/3T3細胞，然后將該細胞移植入大鼠的蛛網膜下腔進而評價神經性疼痛治療的效果，結果表明成纖維細胞系NIH/3T3能表達β內啡肽基因，HPPE作為轉基因鎮(zhèn)痛治療難治性疼痛是可行的�；蜴�(zhèn)痛研究中常用的載體有病毒載體與非病毒載體，病毒載體攜帶外源基因和相關基因元件，并被包裝成病毒顆粒可整合入不能分裂增殖神經元細胞內進行表達。在體內外實驗中使用較多，但其來源于病毒存在自身免疫原性和造成細胞病理改變等特性，其臨床應用也受到限制[7]。而非病毒基因載體則以其設計靈活、低免疫原性、低毒性、低致癌性、外源基因整合幾率低、無基因插入片段大小限制、易制備、長期表達等優(yōu)點，成為基因治療新選擇。在國內華中科技大學徐穎等[8]人，將前腦啡肽基因連接到真核載體上，利用逆轉錄病毒四環(huán)素調控系統(tǒng),建立四環(huán)素調控表達人前腦啡肽原基因的大鼠星形膠質細胞系，將來移植到體內，可依據疼痛程度，調控疼痛基因表達時間與水平，這使得基因治療與臨床應用又近了一步。
