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醫(yī)學論文范文:人骨髓間充質干細胞對異體外周血T淋巴細胞的抑制作用及機制
【摘要】 目的： 探討骨髓間充質干細胞（MSCs)體外對異體外周血T淋巴細胞的抑制作用及機制. 方法： 從骨髓中分離培養(yǎng)MSCs，反復貼壁進行純化；用尼龍棉柱法純化異體外周血T淋巴細胞；觀察MSCs對植物血凝素（PHA)刺激下T淋巴細胞增殖的影響，用ELISA方法檢測IFNγ，IL4水平變化. 結果： MSCs對PHA誘導的T淋巴細胞增殖有抑制作用，并呈劑量依賴性；同時MSCs亦可抑制T淋巴細胞的IFNγ分泌，但可促進IL4的分泌. 結論： MSCs對異體外周血T淋巴細胞的增殖有抑制作用，其作用可能與其影響T淋巴細胞分泌IFNγ和IL4有關.
【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；T淋巴細胞；免疫調節(jié)；干擾素γ；白細胞介素4
0引言
骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中不同于造血干細胞的另一類成體干細胞，這類細胞易于采集、分離和體外擴增，除具有高度增殖及多向分化潛能、促進機體造血重建外，還具有抑制同種異體免疫反應、減輕移植排斥等免疫調節(jié)作用，但具體機制還不清楚. 為進一步探討MSCs的免疫調節(jié)功能，我們研究了MSCs對T淋巴細胞增殖及其分泌IFNγ與IL4的影響.
1材料和方法
1.1骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10)，DMEM（Gibco)倍比稀釋，F(xiàn)icoll分離液（天津灝洋)2000 r/min,15 min條件下分離出單個核細胞，DMEM洗滌2次，完全培養(yǎng)基（100 g/L胎牛血清+ DMEM)重懸細胞，以2×109/L接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內，37℃，50 mL/L CO2孵箱內培養(yǎng)，24 h首次換液，以后每2～3 d換液1次，細胞融合度達80%時消化傳代培養(yǎng)，流式細胞儀分析檢測傳至3代MSCs的純度醫(yī).學全.在.線網站m.gydjdsj.org.cn.
1.2外周血T淋巴細胞的分離與純度鑒定取新鮮肝素抗凝人外周血20 mL，F(xiàn)icoll分離液（2000 r/min,15 min)分離出單個核細胞，尼龍棉柱法進一步分選T淋巴細胞，流式細胞儀分析尼龍棉柱分離前后T淋巴細胞的純度.
1.3MSCs對植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)作用下的T淋巴細胞增殖的影響取第3代培養(yǎng)的MSCs，經60Co照射30 Gy，調整細胞密度，按細胞數(shù)分為3組，A組1×103個，B組1×104個，C組1×105個，每組設單獨同等數(shù)量MSCs為空白對照，以單獨T淋巴細胞培養(yǎng)為陽性對照. 以終體積100 μL／孔，加入96孔培養(yǎng)板內，MSCs完全貼壁后吸去上清或更換培養(yǎng)液，并除空白對照外各組加入T淋巴細胞1×104/孔. 經PHA 5 μg（Sigma)作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma)繼續(xù)孵育4 h，棄上清后二甲基亞砜固定，酶標儀490 nm處測定A值，增殖百分率=（實驗組A值-對照組A值)/實驗組A值.
1.4MSCs對PHA刺激下的T淋巴細胞IFNγ，IL4分泌的影響分別用1×107/L，1×108/L MSCs與1×109/L的T淋巴細胞共培養(yǎng)，同時加入5 μg 的PHA. 應用IFNγ，IL4試劑盒（武漢博士德)檢測各組培養(yǎng)上清中IFNγ和IL4濃度.
統(tǒng)計學處理：應用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果用x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnettt檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學差異.
2結果
2.1MSCs與T淋巴細胞純度鑒定原代MSCs形態(tài)均勻一致，呈長梭形，流式細胞儀結果顯示：傳至3代MSCs高表達CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或極低表達，純度達90%以上；異體外周血單個核細胞經尼龍棉柱分離后CD3+細胞百分比達98%以上.
2.2MSCs抑制T淋巴細胞的增殖MSCs對PHA刺激下的T淋巴細胞增殖呈抑制效應，并呈劑量依賴性. 單純RPMI1640培養(yǎng)基條件下，T淋巴細胞陽性對照組的增殖率為（77.05±1.94)%，A，B，C組依次為（44.94±5.84)%，（33.45±7.00)%，（17.64±4.59)%，與陽性對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.05).
2.3MSCs抑制T淋巴細胞IFNγ的分泌在單純培養(yǎng)條件下，T淋巴細胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ為（79.16±13.40)ng/L，與1×107/L，1×108/L的MSCs共培養(yǎng)時IFNγ的分泌分別為（25.54±7.05)，（9.55±3.60)ng/L，IFNγ分泌明顯減少（P<0.05).
2.4MSCs促進T淋巴細胞IL4的分泌在單純培養(yǎng)條件下，T淋巴細胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量為（46.04±9.67)ng/L，加入1×107/L，1×108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分別為（67.10±11.44)，（97.92±19.48)ng/L，與單純T淋巴細胞培養(yǎng)組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05).
