綜合性實驗二幽門螺桿菌的PCRRFLP分型
一厭氧菌的檢驗
由于機體的防御機能減弱；皮膚或粘膜受損；長期使用免疫抑制劑和廣譜抗生素等原因，易
破壞菌群之間的相互制約關(guān)系，即菌群失調(diào)，厭氧菌大量繁殖引起內(nèi)源性或外源性感染。厭
氧菌所致的感染可遍及人體各個部分。據(jù)報道，腹腔、肺、腦、牙周等部位的感染率非常高
。隨著感染類型的改變，厭氧菌的檢出尤為重要。
圖10厭氧罐示意圖
對厭氧菌的鑒定分類主要依據(jù)兩個重要特性，一是基因型特性：如DNA的G+Cmol%含量和DNA
同源性。二是表型特性：包括形態(tài)(大小、形狀、動力和芽胞等)、細胞壁成分、能量代謝類
型及發(fā)酵產(chǎn)物。
一厭氧菌的培養(yǎng)方法
現(xiàn)代厭氧培養(yǎng)技術(shù)的基本要求，一是保持無氧環(huán)境；二是要保持培養(yǎng)基呈還原狀態(tài)。為了
達到上述目的，措施很多，主要有利用催化劑、還原劑和氣體置換三個方面。國內(nèi)外比較通
用的有厭氧罐法、生物袋法、厭氧箱法和生物耗氧法(如皰肉培養(yǎng)基)。
厭氧罐法厭氧罐(見圖10)是由塑料、有機玻璃制成的圓柱形容器
，罐口與蓋子通過有旋鈕
的金屬夾子緊緊封閉。厭氧罐的使用通常采用抽氣換氣法，需要一臺真空泵、兩個氣體瓶：
一個混合氣體瓶(含N280%，CO210%，H210%)和一個高純氮氣瓶，以及鈀催化劑和亞甲
藍指示劑。
混合氣體中的H2和CO2是厭氧培養(yǎng)所不可缺少的，H2在催化劑的作用下與罐內(nèi)殘余的O
2化合
成水；CO2則是許多細菌生長所必需的。亞甲藍是氧化還原指示劑，有氧時呈藍色，無氧
時
為無色。試驗時，將亞甲藍溶液(氧化型)隔水煮沸使藍色變?yōu)闊o色(還原型)。然后，立即放
入?yún)捬豕迌?nèi)，如罐內(nèi)保持無氧狀態(tài)，亞甲藍溶液無色；如罐內(nèi)有氧氣，亞甲藍溶液變?yōu)樗{色
。
厭氧罐的使用操作步驟是將接種標(biāo)本的平皿(宜正放)或試管(松開塞子)放入?yún)捬豕迌?nèi)，同時
放入催化劑和指示劑。擰緊蓋子，開始抽氣，待抽到—600～-740mmHg時，停止抽氣，灌入
高純氮氣，使壓力表指針退回“0”為止。如此反復(fù)抽氣灌氣2～3次，最后一次灌入混合氣
體，封閉氣道，將厭氧罐置37℃溫箱內(nèi)孵育。
厭氧箱法厭氧箱是目前開展厭氧菌工作最先進的設(shè)備，可以接受
處理大量標(biāo)本，全部操作
(包括細菌的接種、培養(yǎng)、鑒定)均在完全無氧條件下進行，避免了用其它方法因操作暴露于
空氣中太久，致使部分厭氧菌死亡的缺點，這無疑有利于厭氧菌的檢出。厭氧操作箱一般都
具備下述部件：操作室、進出口小室、催化劑板盒、孵育箱、厭氧度指示劑、真空度表和
電熱器等。
二厭氧菌的分離培養(yǎng)
1、厭氧菌的常規(guī)分離程序
2、厭氧菌分離培養(yǎng)要點
(1)正確地采集標(biāo)本并在無氧環(huán)境下立即送實驗室。
(2)收到標(biāo)本后應(yīng)盡快進行接種培養(yǎng)。
(3)使用的厭氧培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。
(4)有合格的厭氧培養(yǎng)條件和可靠的分析鑒定方法。
3、初代培養(yǎng)應(yīng)注意的問題
(1)厭氧菌的初代培養(yǎng)除某些脆弱類桿菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌生長較快外，一般生長較慢。故一
般至少需培養(yǎng)48小時后才能取出觀察。
(2)對于病情緊急的病例可行雙份培養(yǎng)。一份培養(yǎng)18～24小時觀察；另一份培養(yǎng)3～5天觀察
。
(3)厭氧培養(yǎng)48小時無生長者，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)5天以上，培養(yǎng)2周仍無生長者即可報告陰性。
二幽門螺桿菌的分型
1983年，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,簡稱HP)由Warren和Mashall等人首次從人胃粘
膜中分離出。十多年的研究表明：HP感染是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，并與
胃癌及胃的淋巴瘤有密切的關(guān)系。目前，HP已成為微生物學(xué)、流行病學(xué)和消化內(nèi)科學(xué)研究的
熱點之一。
迄今為止，HP感染的容易復(fù)發(fā)原因、傳染源及傳播途徑尚不清楚。為了闡明這些問題，應(yīng)建
立一種分辨力高、重復(fù)性好和快速的HP分型方法。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是PCR
技術(shù)，被引入微生物分型研究，細菌分型技術(shù)及其應(yīng)用取得了很大進展。
一HP基因分型方法
基因分型方法主要有：質(zhì)粒分型法、染色體DNA限制性核酸內(nèi)切酶分析法、染色體DNA脈沖場
凝膠電泳法、基因探針法、PCR擴增產(chǎn)物酶切分析法、PCR單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法和核苷酸序
列分析法。
1、染色體DNA限制性核酸內(nèi)切酶分析法(見微生物快速診斷新技術(shù)
一節(jié))
2、基因探針法
HP染色體DNA經(jīng)核酸內(nèi)切酶酶切、電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，加入標(biāo)記
的
細菌16S+23SrRNA基因或其它核苷酸探針，作Southern印跡分析，不同HP菌株的雜交條帶的
數(shù)目和位置不同，即菌株之間存在限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length p
olymorphisms,RFLP)。根據(jù)RFLP譜型，可判斷不同菌株的親緣關(guān)系。如果兩個HP分離株的RF
LP圖譜存在明顯差異，就認為屬于不同型；如差異較小，可認為屬于同一型中的不同亞型。
基因探針分型法雜交條帶為2～10條，結(jié)果易于觀察，分辯力高，重復(fù)性好，不需要特殊的
實驗儀器�，F(xiàn)在傾向于用地高辛標(biāo)記探針，無放射性危險。探針制備和標(biāo)記可利用PCR技術(shù)
，方法簡單、快速、產(chǎn)量高，PCR產(chǎn)物不需提純，可直接用于Southern雜交，標(biāo)記好的探針
可在—20℃保存一年以上。但是，基因探針法耗時較長，技術(shù)要求高，并需要首先提取和定
量純化的染色體DNA。
3、PCR擴增產(chǎn)物酶切分析法
利用PCR技術(shù)擴增HP的某一特定序列(如尿素酶基因)，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖
凝膠電泳分離后，顯示出簡單直觀的RFLP譜型，即不同HP菌株的酶切片段的數(shù)目和大小不同
。
PCRRFLP分型法重復(fù)性極好、分辨力高，尤其是利用PCR技術(shù)，只需少量細菌通過煮沸法裂
解細菌，獲得DNA粗提液作為模板；也可直接檢測胃粘膜標(biāo)本中的微量靶DNA。整個實驗可在
數(shù)小時內(nèi)完成，便于對大量標(biāo)本進行分析。擴增的片段越長，分型效率越高，但擴增的片段
超過1Kb，PCR的重復(fù)性不很穩(wěn)定。
二分型方法在HP研究中的應(yīng)用
1、研究HP感染復(fù)發(fā)的原因
感染HP的病人經(jīng)抗生素治愈后很快復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率可高達80%。復(fù)發(fā)是由治療前感染的HP菌株
導(dǎo)致，還是由于感染了新的HP菌株?這一問題的闡明，對臨床治療選擇用藥很重要。單純從
復(fù)發(fā)病人中分離出HP菌株是不夠的，還必須對治療前后HP分離株進行基因分型�，F(xiàn)有實驗證
據(jù)表明，復(fù)發(fā)是由治療前感染的HP持續(xù)感染所致，并且相當(dāng)一部分病人可能感染了多個亞型
的HP。
2、研究HP感染的傳播途徑
目前認為人類是HP的主要傳染源，人——人傳播(口——口傳播和糞——口傳播)為主要傳播
方式。HP感染與某些動物和環(huán)境因素也有密切關(guān)系。
HP在世界各地普通人群中年齡組的感染率從1～79%不等，多數(shù)地區(qū)在40%左右。流行病學(xué)調(diào)
查提示HP感染存在一定的家庭和人群聚集現(xiàn)象，父母為HP感染者的兒童中，其HP感染率遠高
于父母未感染者。利用PCR技術(shù)，可在唾液、牙斑和糞便中檢出HP，并且牙斑和胃粘膜中HP
的分型結(jié)果一致，提示HP感染存在口——口和糞——口傳播。成功的抗生素治療后，HP感染
復(fù)發(fā)原因可能之一是，抗生素殺滅了胃內(nèi)的HP，但口腔牙斑中的HP未被殺死，可再進入胃內(nèi)
，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。
HP有可能對人和某些種屬動物具有感染性，人可能通過與動物的接觸或通過食用肉類食物而
感染HP。如從貓胃內(nèi)分離出貓胃螺桿菌，經(jīng)形態(tài)染色、培養(yǎng)及生化特征、脂肪酸分析、16Sr
RNA基因序列分析，證實與人類HP十分相近，貓胃的病變與人的病變類似，表明HP存在動物
源性傳染源，可通過動物與人的密切接觸而感染人。
三幽門螺桿菌的分離與鑒定
Isolation and Identification of H.pylori
【實驗?zāi)康摹?/p>
1掌握微需氧培養(yǎng)技術(shù)。
2了解幽門螺桿菌分離培養(yǎng)與鑒定的常規(guī)方法。
【實驗原理】
幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性微需氧菌，必須在微需氧條件下才能生長，可以采用厭氧罐培
養(yǎng)法。先抽去罐內(nèi)空氣，然后充入N2、CO2和H2混合氣體，使之達到微需氧狀態(tài)。
幽門螺桿菌能產(chǎn)生大量的尿素酶，分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基酸堿度上升而變成堿性
，加入酚紅指示劑呈紅色，是為陽性反應(yīng)。因此，可利用快速尿素酶試驗對幽門螺桿菌加以
鑒定。
【實驗內(nèi)容和方法】
一培養(yǎng)基的制備
【材料】
空腸彎曲菌選擇性培養(yǎng)基羊血混合抗生素
【方法】
1稱取適量的空腸彎曲菌選擇性培養(yǎng)基，置于三角燒瓶中，加入適量蒸餾水，充分溶解。
2高壓蒸汽滅菌(121℃)約15～20分鐘。
3待培養(yǎng)基冷卻至50～60℃時，加入7～10%脫纖維羊血或兔血(臨用前37℃預(yù)溫)，混勻。
4初代分離需加混合抗生素(兩性霉素：2ug/ml，萬古霉素：6ug/ml，多粘菌素：2.5IU/ml
)，混勻。
5傾入滅菌的空培養(yǎng)皿制成平板，或傾入試管中制成斜面。由于加有混合
抗生素，故為幽門螺桿菌選擇性培養(yǎng)基。
二幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)
【材料】
胃粘膜活檢標(biāo)本幽門螺桿菌選擇性培養(yǎng)基(平板)接種環(huán)混合氣體厭氧罐抽氣換氣
裝置超凈工作臺
【方法】
1將胃粘膜活檢標(biāo)本(最好采用尿素酶強陽性標(biāo)本)直接涂抹接種于幽門螺桿菌選擇性培養(yǎng)
基(平板)上，將平板置于厭氧罐內(nèi)，并放置兩個裝有滅菌水的試管，以保持一定的濕度。
2抽氣：將厭氧罐的抽氣橡皮管插在真空泵的抽氣接口上，打開真空泵電源開關(guān)，抽至壓
力表指針至—500mmHg時，用止血鉗夾住與真空泵相連的橡皮管，關(guān)閉電源。
3換氣：打開混合氣體鋼瓶氣閥，向厭氧罐中充入混合氣體(80%氮氣，10%氧氣和10%二氧
化碳)，使真空表指針返回到零位，用止血鉗夾住罐體的排氣管以封閉厭氧罐，同時關(guān)閉混
合氣體鋼瓶閥門。
4將厭氧罐置于37℃培養(yǎng)3～7天后觀察結(jié)果。
三幽門螺桿菌的鑒定
【材料】
結(jié)晶紫染液蘆戈氏碘液95%酒精稀釋石炭酸復(fù)紅普通光學(xué)顯微鏡尿素酶微量管A
PI鑒定卡
【方法】
1菌落特征觀察：幽門螺桿菌在血平板上的菌落呈圓形，凸起，光滑，透明或半透明，有
光澤，邊緣整齊，無色或灰白色，菌落大小為0.5～1mm，可輕度溶血。
2革蘭氏染色鏡檢：挑取可疑的單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上增菌、純化，37℃微需氧條
件下培養(yǎng)2～3天。取少許菌苔制成涂片，進行革蘭氏染色鏡檢，幽門螺桿菌為革蘭氏染色陰
性
，呈弧形、S形、海鷗展翅形或稍彎桿狀，但在4天以上的培養(yǎng)物中大多數(shù)細菌逐漸變短，呈
逗點形且著色不均，最后變成球形。
3尿素酶試驗：挑取少許菌苔，接種于尿素酶分解微量管中，30秒至數(shù)分鐘
內(nèi)指示劑變?yōu)榧t色，即尿素酶試驗強陽性。以變形桿菌和大腸桿菌作為對照。
4API鑒定：方法詳見綜合性實驗一·十·API鑒定系統(tǒng)及其在微生物檢驗中的應(yīng)用。
四幽門螺桿菌染色體DNA的提取
Isolation of Chromosomal DNA of H.pylori
【實驗?zāi)康摹?/p>
掌握染色體DNA提取的原理和常規(guī)方法。
【實驗原理】
提取DNA前需將細菌細胞壁斷裂(可用溶菌酶消化)，再加入SDS和蛋白酶K消化，一方面有效
地破裂細胞，使核酸從蛋白質(zhì)里釋放出來，另一方面抑制核酸酶的作用，以避免DNA降解。
除去蛋白質(zhì)最常使用的方法是用苯酚—氯仿—異戊醇混合液抽提。離心后，含蛋白質(zhì)和
脂質(zhì)的酚層為下層，而上層水相中含有核酸，變性的蛋白質(zhì)在中間形成不溶層。提取后，必
須再用氯仿—異戊醇
混合液提取。氯仿的作用是使蛋白質(zhì)表面變性，同時除去殘留的苯酚。異戊醇的作用則是減
少泡沫，有助于分離。最后，在高鹽條件下用冷乙醇沉淀
DNA，同時除去殘存的氯仿。沉淀的DNA用離心法收集。沉淀DNA用70%乙醇洗滌以除去殘存的
鹽離子。在提取和轉(zhuǎn)移DNA上清液時應(yīng)小心，以防機械剪切力使DNA斷裂。
【實驗內(nèi)容和方法】
一幽門螺桿菌染色體DNA的提取
【材料】
溶菌酶蛋白酶K苯酚氯仿異戊醇無水乙醇3MNaAc70%乙醇
【方法】
1將幽門螺桿菌新鮮菌苔用布氏肉湯洗下，離心6000轉(zhuǎn)/分，5min。
2沉淀用緩沖液(50mMTrisHCl(pH8.0),20mM EDTA)1.0ml于振蕩器上混勻，離心6000轉(zhuǎn)/
分5min，洗兩次。
3沉淀混懸于緩沖液(50mM TrisHCl(pH8.0),2mM EDTA)0.5ml，加溶菌酶終濃度為3mg/ml
，37℃作用30min。
4加SDS終濃度0.5%，作用1小時。
5加蛋白酶K終濃度200ug/ml，作用2小時。
6加等體積酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1)，抽提兩次。
7加等體積氯仿：異戊醇(24∶1)，抽提1次。
8加醋酸納至終濃度為0.3M，2～2.5倍無水乙醇，—20℃放置3小時。
9離心13000轉(zhuǎn)/分，15min。
10加入70%冷乙醇(保存于4℃)洗DNA沉淀兩次，離心12000轉(zhuǎn)/分，5min。
11真空干燥DNA 5min。
12每管DNA用50ul滅菌三蒸水或緩沖液(10mM TrisHCl(pH8.0),1mM EDTA)溶解。短期保
存(數(shù)周)于4℃，長期保存(數(shù)月)于—70℃.
二DNA定量
取DNA液2ul加18ul滅菌三蒸水，以滅菌三蒸水為空白對照，于紫外分光光度計上測其260nm
和280nm的吸光值，并計算260nm/280nm比值。
五幽門螺桿菌尿素酶C基因的PCR擴增
PCR Amplifcation of H.pylori Urese C Gene
【實驗?zāi)康摹?/p>
1熟悉PCR擴增原理及影響因素。
2掌握PCR擴增技術(shù)。
【實驗原理】
聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種選擇性體外基因擴增的方法(祥見綜
合實驗一、十)。PCR擴
增DNA片段的特異性是由兩個人工合成的寡核苷酸引物的順序決定的。PCR是一反復(fù)進行的熱
變性——復(fù)性——延伸的循環(huán)過程，即：
①變性：應(yīng)用高溫(一般為94℃)使靶DNA解鏈；
②復(fù)性：溫度降低時，靶DNA與兩個寡核苷酸引物雜交；
③延伸：在Taq DNA聚合酶(一種耐高溫的酶)和4種三磷酸脫氧核糖核苷(dATP、dTTP、dCTP
、dGT
P或dNTP)存在和適宜溫度(一般為72℃)下，以靶DNA為模板，引物沿著靶DNA鏈3′到5′方向
延伸，自動合成新的DNA鏈，使DNA重新變成雙鏈。
這三個步驟反復(fù)地進行30次左右，即可在幾小時內(nèi)將靶DNA擴增上百萬倍，經(jīng)瓊脂糖凝膠電
泳溴化乙錠染色后，在紫外燈下肉眼可見DNA條帶。
【實驗內(nèi)容和方法】
一引物設(shè)計
引物15′TTTGGGACTGATGGCGTGAGGGGTAA3′
引物25′GGACATTCAAATTCACCAGGTTTTGAGG3′
引物互補于HP尿素酶C基因，擴增片段為1132bp。
二PCR擴增尿素酶C基因
【材料】
Taq DNA酶10×PCR緩沖液4種dNTPMgCl2溶液DNA擴增儀微量取樣器吸頭
Eppendorf管模板DNA
【方法】
1加樣：取滅過菌的0.5mlEppendorf管，用微量取樣器依次加入模板DNA10～100ng，四種
脫氧核苷
酸(dATP、dCTP、dTTP、dGTP)分別為200uM，引物各為0.4uM，10×緩沖液10ul，MgCl2溶
液1
0ul(最終濃度為1.5mM)，最后加入滅菌三蒸水使總體積為100ul，混勻后，加入100ul滅菌液
體石蠟油覆蓋。
2PCR擴增：在PCR熱循環(huán)儀上進行。加Taq DNA聚合酶前，100℃ 5min，1個循環(huán)
；加入Taq DNA聚合酶后，94℃(變性)1.5min，55℃(退火)1min，72℃(延伸)2min
，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。
【注意事項】
●加Taq DNA聚合酶前，可將Eppendorf管直接在沸水中煮沸5min，離心數(shù)秒后加酶，最后再
加入石蠟油。
三PCR擴增產(chǎn)物的檢測
【材料】
電泳儀電泳槽瓊脂糖溴乙錠微量取樣器紫外檢測儀
【方法】
1制膠：稱取一定量的瓊脂糖，加入TBE電泳緩沖液，加熱溶化，再加入溴乙錠至最終濃
度為0.5ug/ml，混勻后傾注電泳板中，制成2%瓊脂糖凝膠。待凝膠冷卻后，取出點樣孔梳
，置于電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，恰好沒過膠面約1mm深。
2點樣：用微量取樣器取PCR產(chǎn)物5ul和少量溴酚蘭(作為指示劑)加入到瓊脂糖凝膠孔中。
同時加入標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA溶液作為對照。
3電泳：接通電源，電壓為5V/cm。
4結(jié)果判斷：電泳結(jié)束后，小心取出凝膠置于紫外燈下觀察。非幽門螺桿菌為陰性反應(yīng)，
幽門螺桿菌為一條清晰可見的DNA條帶。
【問題】
①作PCR擴增時應(yīng)設(shè)立哪些對照?為什么?
②如何檢測PCR擴增反應(yīng)的特異性和敏感性?
六幽門螺桿菌尿素酶C基因的RFLP分析
PCRBase RFLP Analysis of H.pyl執(zhí)業(yè)藥師ori Urease C Gene
【實驗?zāi)康摹?/p>
1了解PCRRFLP分型方法的原理及結(jié)果判斷。
【實驗原理】
尿素酶C基因長為1132bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化、瓊脂糖凝膠電泳分離后，顯示出簡單直觀
的RFLP譜型，即不同HP菌株的酶切片段的數(shù)目和大小不同，據(jù)此可將細菌分為不同型或亞型
。結(jié)果顯示：尿素酶C基因經(jīng)HaeⅢ或HindⅢ酶切后，可見2～3條帶；經(jīng)AluⅠ酶切后產(chǎn)生4條
DNA條帶。綜合分析可分為多種酶切類型。
【實驗內(nèi)容和方法】
一PCR擴增產(chǎn)物酶切分析
1取HP尿素酶C基因的PCR擴增產(chǎn)物各510ul，分別用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HindⅢ、AluⅠ
、PvuⅠ1020U，按廠家說明操作，37℃作用4小時。
2幽門螺桿菌尿素酶C基因經(jīng)核酸內(nèi)切酶消化后，取消化后產(chǎn)物10ul，加入到2%瓊脂糖凝膠
上電泳。點樣孔梳可根據(jù)樣品數(shù)目、點樣量等作出選擇。對于一定量的樣品來說，寬而薄的
梳子可產(chǎn)生較細而平直的帶，適合于酶切圖譜的分析。
3在紫外燈下觀察酶切圖譜，拍照。
【問題】
PCRRELP分型的原理是什么?有何實際意義?
(龍北國龍敏張文炳羅軍)
