實(shí)驗(yàn)十七 病毒的培養(yǎng)
病毒與細(xì)菌不同，它必須依賴宿主細(xì)胞才能增殖。采用組織培養(yǎng)分離病毒，常用的方法為雞胚培養(yǎng)、單層細(xì)胞培養(yǎng)法及組織塊法。后兩者均能在顯微鏡下直接觀察正常細(xì)胞的形態(tài)，一般分為梭形(成纖維樣)及多角形(上皮樣)兩類。
一、雞胚培養(yǎng)法
雞胚培養(yǎng)法為常用的病毒培養(yǎng)方法之一，用于對(duì)痘類病毒、粘病毒和皰疹病毒的分離、鑒定、制備抗原、以及研究病毒性質(zhì)等方面。由于雞胚培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便、受精雞卵來(lái)源豐富，雞胚本身帶病毒的情況少見，特中國(guó)衛(wèi)生人才網(wǎng)別是雞胚感染粘病毒后，在它的羊水和尿囊液中有大量的游離病毒存在，對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞可產(chǎn)生血凝現(xiàn)象，因此為初步鑒定病毒提供了一個(gè)依據(jù)。其接種方法有雞胚絨毛尿囊膜接種法、羊膜腔接種法及尿囊腔接種法等。在此實(shí)驗(yàn)中僅介紹后兩種方法。
【材料】
流感病毒10－3稀釋液，9-12d齡雞胚、無(wú)菌1ml注射器及7～9號(hào)針頭、鋼鉆、磨牙鉆、彎頭小鑷、滅菌液體石蠟、滅菌毛細(xì)吸管等。
【方法】
1．雞卵的孵化：選大而殼薄的雞蛋，用酒精棉球輕拭外殼以除去污物，置于38-39℃的溫箱中孵化，箱內(nèi)必須保持相當(dāng)?shù)臐穸�，雞卵每天翻動(dòng)1-2次，受精的雞卵4-5d后即可見到胚胎和血管。
2．雞胚羊膜腔接種法：(圖17-1)
(1) 操作前一天將卵的小端向下直立培養(yǎng)，使胚胎浮在氣室下，便于操作。
(2) 接種前檢查雞胚生活情況，并用鉛筆劃出氣室和胚胎的位置，然后用磨牙鉆在靠近胚胎側(cè)磨一方形小窗，每邊約1cm。
(3) 用小鑷挑去卵殼，撕去卵膜，再滴兩滴石蠟油于卵膜上，石蠟油在卵膜上散開使膜透明，這樣在照明燈照射下，整個(gè)雞胚明顯可見。
(4) 用滅菌1ml注射器抽取少許流感病毒，將針頭對(duì)準(zhǔn)雞胚直下，穿過(guò)絨毛尿囊膜和羊膜進(jìn)入羊膜腔，為了試針探頭針是否確實(shí)已到羊膜腔內(nèi)，可用針頭輕擊小雞嘴部，小雞立即動(dòng)彈表示針頭已進(jìn)入羊膜腔，推動(dòng)注射器，注入0.1-0.2ml。
(5) 注射完畢后用膠布封口(膠布先經(jīng)碘酒處理，并通過(guò)火焰燒去余碘)，用過(guò)的注射器經(jīng)煮沸消毒，接種的雞胚置于35-36℃的溫箱中孵育48-72h。
(6) 自接種后次日起逐日檢查雞胚生活情況，兩日以內(nèi)死亡者多與病毒接種無(wú)關(guān)，收獲病毒前將雞胚放入4℃的冰箱中使雞胚凍死以避免收獲時(shí)出血。
(7) 自冰箱內(nèi)取出雞胚，用碘酒消毒氣室端，撕去膠布，并將蛋殼擴(kuò)大，用小鑷撕去卵膜及絨毛尿囊膜，然后用毛細(xì)吸管除去囊液，再用左手持鑷，鑷住羊膜腔，用毛細(xì)管插入羊膜腔吸取羊水，一般可吸出羊水1ml左右。
(8) 檢查羊水有無(wú)凝集雞紅細(xì)胞的作用。
圖17-1 雞胚羊m.gydjdsj.org.cn/jianyan/膜腔接種法 圖17-2 雞胚尿囊腔接種法
3、雞胚尿囊腔接種法：(圖17-2)
(1) 檢查雞胚生活的情況，用鉛筆標(biāo)明天然氣室，然后在絨毛尿囊膜發(fā)育區(qū)避開大血管處作一直徑為1mm的小園圈定為注射入口。
(2) 用碘酒少許消毒注射人口和天然氣室的頂端，再用75％的酒精洗去碘。
(3) 用鋼鉆經(jīng)過(guò)火焰消毒，在注射入口以及氣室頂端鉆孔。
(4) 用滅菌的1ml注射器抽取病毒液體0.1～0.2ml刺入約0.5cm深后注入。
(5) 注射完畢后，用小鑷夾一小塊膠布沾95％酒精少許通過(guò)火焰燃燒以達(dá)到消毒目的后，迅速將火焰熄滅，將注射人口及氣室的小孔封貼。
(6) 培養(yǎng)收獲同羊膜腔接種法，尿液及羊囊液均可收獲。尿囊接種法適于流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒以及新城雞瘟病毒的傳代。但分離培養(yǎng)陽(yáng)性率不及羊囊接種法。
(7) 取清潔試管2只，標(biāo)記“1”、“2”。試管內(nèi)加入收獲的尿囊液搖勻，置室溫中半小時(shí)后觀察有無(wú)血凝現(xiàn)象并記錄結(jié)果。
二、原代人胚腎單層細(xì)胞制備
原代細(xì)胞為直接采自動(dòng)物或人組織如人胚腎、人羊膜、猴腎等。人胚腎為實(shí)驗(yàn)室常用的組織。
【材料】
1．4～6個(gè)月齡新鮮的胎兒(水囊引產(chǎn)或早產(chǎn)死胎)。
2．Hanks液、0.25%胰酶、營(yíng)養(yǎng)液〔含10%胎牛血清，0.5%水解乳蛋白、三抗(青霉素、鏈霉素、卡那霉素)〕。
3．5.6%碳酸氫鈉溶液。
4．無(wú)菌培養(yǎng)小瓶、三角燒瓶、吸管、眼科小剪刀及小鑷子、橡皮塞。
【方法】
1．取胚腎：胎兒取俯臥位，用3％碘酒消毒背部及臀皮膚，剪開脊柱兩側(cè)皮膚及皮下組織。自肋緣下剪開骶嵴肌，鈍性分離拉開切口，用止血鉗或鑷子夾取腎臟，分離腎周組織，取出腎臟放入無(wú)菌平皿中。
2．剪取皮質(zhì)：將腎包膜剝?nèi)�，用眼科剪刀從腎表面剪取皮質(zhì)，除去髓質(zhì)。將皮質(zhì)置營(yíng)養(yǎng)小瓶?jī)?nèi)，剪成1～3mm3小塊，用Hanks液洗數(shù)次，直至液體清晰為止。
3．消化：將組織小塊移入三角燒瓶?jī)?nèi)，加0.25%胰酶10ml，同時(shí)加入0.1ml三抗溶液，將pH調(diào)至8.0左右置4℃冰箱消化18h左右。取出后用Hanks液輕輕洗3次，以除去剩余的胰酶溶液。
4．分散細(xì)胞：加入營(yíng)養(yǎng)液10ml，用刻度吸管吹打，直至組織塊細(xì)小至不可見，全部成為分散細(xì)胞為止。
5．細(xì)胞計(jì)數(shù)：吸0.1ml細(xì)胞懸液，加入0.9ml Hanks液，混勻后吸出少量懸液滴入血球計(jì)數(shù)板，用低倍鏡計(jì)算，并按下列公式計(jì)算每ml細(xì)胞數(shù)。(4大格細(xì)胞數(shù)/4×10,000×10=每ml細(xì)胞數(shù))。
6．細(xì)胞分裝及培養(yǎng)：將已計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液，用營(yíng)養(yǎng)液稀釋至每毫升含40萬(wàn)～50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，將此細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)小瓶，每瓶lml，用橡皮塞塞好，充分搖勻置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，以后每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。一般于次日即可見細(xì)胞粘于管壁，3～7d長(zhǎng)成單層后可使用。
三、HeLa細(xì)胞培養(yǎng)法
腫瘤組織經(jīng)過(guò)多次傳代可建立傳代細(xì)胞系，這種細(xì)胞能無(wú)限傳代。HeLa細(xì)胞來(lái)自子宮頸癌組織，對(duì)多種腸道病毒及腺病毒均敏感，故可用于這些病毒的分離。
【材料】
1．傳代HeLa細(xì)胞系培養(yǎng)瓶。
3．0.25%胰蛋白酶、三抗、營(yíng)養(yǎng)液。
4．5.6%碳酸氫鈉。
5．無(wú)菌培養(yǎng)瓶，吸管等。
【方法】
1．棄去傳代HeLa細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的營(yíng)養(yǎng)液。
2．加入5m1 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃孵育1～2min。
3．放置細(xì)胞瓶使細(xì)胞在上，胰酶溶液在下，繼續(xù)孵育5～10min。
4．除去胰蛋白酶，加入原量的生長(zhǎng)液，用10ml吸管吹打分散細(xì)胞。
5．用營(yíng)養(yǎng)液按原量作3倍稀釋。然后用1ml吸管分裝培養(yǎng)小瓶，使每小瓶含1ml細(xì)胞懸液，置37℃培養(yǎng)。
6．單層細(xì)胞的生長(zhǎng)：培養(yǎng)24h后，HeLa細(xì)胞貼于培養(yǎng)瓶壁，表現(xiàn)為單個(gè)或2～3個(gè)細(xì)胞聚集成的小島，隨后細(xì)胞開始分裂繁殖，一般3～7d長(zhǎng)成單層。HeLa細(xì)胞的形態(tài)為多形的上皮樣細(xì)胞。
四、病毒對(duì)細(xì)胞致病作用的觀察
【材料】
1．HeLa細(xì)胞培養(yǎng)小瓶。
2．脊髓灰質(zhì)炎病毒毒種，腺病毒毒種。
3．細(xì)胞維持液(含5%小牛血清，5%水解乳蛋白的Hanks液，其中含有青霉素100u/ml、鏈霉素與卡那霉素各100μg/ml，pH調(diào)至7.4～7.6)。
4．1ml吸管等。
【方法】
（一)接種病毒
1．選擇生長(zhǎng)良好的人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)小瓶，分試驗(yàn)組(接種病毒)和正常細(xì)胞對(duì)照組(不接種病毒)。
2．試驗(yàn)組：傾去營(yíng)養(yǎng)液，每瓶加入維持液0.9ml，然后接種已稀釋的脊髓灰質(zhì)炎病毒液或腺病毒液0.1ml。
3．正常細(xì)胞對(duì)照組：傾去營(yíng)養(yǎng)液后，每瓶加維持液lml。
4．置37℃培養(yǎng)，接種24h后，逐日觀察結(jié)果。
5．接種病毒時(shí)注意事項(xiàng)：
(1) 接種病毒時(shí)需要兩個(gè)人配合，嚴(yán)格無(wú)菌操作。
(2) 接種病毒時(shí)應(yīng)將吸有毒種的吸管伸入到培養(yǎng)小瓶?jī)?nèi)，然后輕輕地吹出毒種，切不可將毒種污染環(huán)境。
(3) 吸毒種的吸管應(yīng)及時(shí)放入消毒缸內(nèi)。
（二)病毒感染細(xì)胞的指標(biāo)
1．pH變化
正常細(xì)胞代謝時(shí)能分解糖類產(chǎn)酸，使維持液中酚紅指示劑由紅色變黃色。但某些病毒增殖后影響正常細(xì)胞代謝，降低了細(xì)胞分解代謝產(chǎn)酸的作用，因此維持液pH仍保持原狀甚至變堿性。這是反映病毒在細(xì)胞中增殖的一個(gè)指標(biāo)。
2．細(xì)胞病變
細(xì)胞受病毒感染后，由于病毒的增殖，使細(xì)胞形態(tài)上產(chǎn)生病理改變，不同病毒引起細(xì)胞病變的特征有所不同，依次可識(shí)別病毒，舉例如下：
(1) 脊髓灰質(zhì)炎病毒：細(xì)胞變圓、縮小，細(xì)胞之間可有拉絲，折光性強(qiáng)，病變細(xì)胞分散較均勻，不成堆聚集，視野較干凈。
(2) 腺病毒：細(xì)胞腫大變圓，常見的3、7、11型可有折光性很強(qiáng)的粗大顆粒，細(xì)胞聚集成葡萄狀，細(xì)胞層間可見明顯撕裂現(xiàn)象。
(3) 皰疹病毒：細(xì)胞腫大變圓，邊緣較薄，有時(shí)有拉絲現(xiàn)象，并可有比一般病變細(xì)胞大數(shù)倍的大圓形細(xì)胞及多核巨細(xì)胞。病變細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核層次較清楚，可見分成三層的靶形病變細(xì)胞。
