PCR的假陽性問題是在PCR誕生之初就被深刻認(rèn)識(shí)到了,同時(shí)由于造成假陽性的因素相對(duì)單一,因此假陽性并不是困惑檢驗(yàn)工作的主要原因。如果一個(gè)項(xiàng)目只是陽性率高敏感性好的話,那么可以認(rèn)為其陰性結(jié)果具備很高的可排除性,仍然有相當(dāng)?shù)呐R床適用價(jià)值。但PCR的假陰性在檢驗(yàn)工作中仍很嚴(yán)重,并且用些因素經(jīng)常被人忽略,嚴(yán)重的影響了PCR的使用?梢韵胂笠环N假陽性和假陰性都很高的項(xiàng)目,有什么樣的診斷價(jià)值。
造成PCR假陰性的原因是復(fù)雜的,也是多樣的。主要有:
1.PCR儀本身的質(zhì)量問題。PCR儀設(shè)計(jì)原理上的差異和經(jīng)常出現(xiàn)的質(zhì)量問題(如:溫控不準(zhǔn)等)給臨床帶來了諸如非特異性擴(kuò)增(假陽性)、擴(kuò)增效率下降(假陰性)等問題。(具體另外講述)
2.離心機(jī)問題。離心機(jī)的質(zhì)量或使用不正確,造成離心標(biāo)本模板沒有分離出來造成假陰性,竊以為這是最易被忽視的問題。其時(shí)離心機(jī)使用問題不僅在PCR,在整個(gè)檢驗(yàn)工作中都是最易被忽視的問題,只是因?yàn)樵谄渌ぷ髦胁幌驪CR那樣明顯影響檢測(cè)結(jié)果罷了。
離心機(jī)是常用的固液分離設(shè)備,其利用離心過程中的離心力而將密度不同的物質(zhì)分離出來。因此離心機(jī)的關(guān)鍵在于離心加速度而不是轉(zhuǎn)速,根據(jù)牛頓定律可知離心力加速度與執(zhí)業(yè)醫(yī)師網(wǎng)轉(zhuǎn)速和有效半徑的有關(guān)的,因此對(duì)于不同有效半徑的離心機(jī)相同的轉(zhuǎn)速其離心加速度是不同的,轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)要因離心機(jī)而異,但很遺憾,日常工作中忽視了這個(gè)問題。有效半徑短的離心加速度就小,同樣的時(shí)間離心效果就差可能造成分離不出導(dǎo)致假陰性。同時(shí)由于高速離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)與空氣摩擦?xí)a(chǎn)生大量的熱,因此對(duì)于稱能上幾萬轉(zhuǎn)/分而沒有抽真空的離心機(jī)實(shí)際轉(zhuǎn)速本人持懷疑態(tài)度。
3.試劑開殼劑和操作問題造成標(biāo)本DNA沒有暴露出來,致使擴(kuò)增無法進(jìn)行,這是造成假陰性的又一主要因素。