將目的基因或序列插入載體，主要靠DNA連接酶和雙鏈DNA粘末端單鏈序列互補結合的配合使用。有以下主要的方式。
一、粘性末端連接
如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核酸內切酶位點，則同一限制酶切開產生的粘末端，在降低溫度退火時，能重新互補結合，在DNA連接酶催化下，目的序列就與載體DNA鏈相連接（見圖20-5)。
圖20-5 同一限制酶切割DNA粘性末端的連接
不同的限制性內切酶切，如果產生的DNA的粘末端相同，也同樣可用此法連接，如識別6bp序列的BamHⅠ和識別4bp序列的Sau3aⅠ切割DNA后都產生5’突出粘性末端GATC，可以互補結合連接。
如果在連接的兩個DNA片段沒有能互補的粘性末端，可用末湍核苷酸轉移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3’末端，例如一般DNA3’端加上polyG，另一股DNA加上polyC，這樣人工在DNA兩端做出能互補的共核苷酸多聚物粘性末端，退炎后能結合連接（圖20-6)，這樣方法稱為同聚物加尾法。
圖20-6 同聚物加尾連拉法
